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目的:牙周炎是一种以牙周结缔组织的破坏降解为特征的细菌感染性疾病,其重要的病理过程为牙周细胞外基质(ECM)的降解、牙槽骨吸收、牙周袋形成,基质金属蛋白酶(MMPs)在这一过程中发挥着重要作用。内毒素(LPS)作为牙周致病菌的主要毒力因子,可激活牙周组织中的主体细胞-牙龈成纤维细胞(HGFs)合成、分泌各种细胞因子及炎症介质,参与牙周组织破坏。本实验旨在探讨一定浓度的内毒素对体外培养的牙龈成纤维细胞(HGFs)在不同时间段分泌基质金属蛋白酶量的影响,同时观察不同浓度的内毒素(LPS)对体外培养的牙龈成纤维细胞(HGFs)在生长、增殖活性方面的影响,从而以细胞分泌的角度为出发点探讨基质金属蛋白酶在牙周炎致病机制中的作用,以期为牙周炎的治疗提供新的思路。方法:1于临床取得正常牙龈组织,采用传统组织块贴壁和改良消化+组织块法两种方法进行人牙龈成纤维细胞的原代培养,运用第三代细胞进行细胞免疫组织化学染色,通过波形丝蛋白和角蛋白染色鉴定细胞来源,通过四唑盐比色法(Methylthiazoletrazolium, MTT)绘制牙龈成纤维细胞的正常生长曲线。2取生长良好的第四代细胞制成4×104/ml的单细胞悬液,每孔200ul均匀接种于96孔板,用不同浓度的内毒素(0.1ug/ml,1ug/ml,10ug/ml,100ug/ml LPS)刺激牙龈成纤维细胞,运用MTT比色检测牙龈成纤维细胞在不同浓度内毒素刺激下的相对增殖率和生长抑制率,从而观察内毒素对牙龈成纤维细胞在生长及增殖活性方面的影响。3 24孔板内以每孔2×10~4的细胞密度将第四代牙龈成纤维细胞接种于盖玻片上,24h细胞贴壁后弃原培养液用2% DMEM培养液静息24h,实验组换含10ug/ml LPS的2% DMEM培养,对照组则不加内毒素刺激只用2% DMEM培养,然后分别在不同的时间段(0h、4h、8h、12h、24h)收集牙龈成纤维细胞的细胞爬片,冰丙酮固定,运用细胞免疫组织化学染色方法SP法检测基质金属蛋白酶1和3(MMP-1, 3)在HGFs中表达的量,从而观察内毒素对牙龈成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶的影响。结果:1细胞免疫组织化学染色结果显示:体外培养的牙龈成纤维细胞均为抗波形丝蛋白染色阳性,阳性部位位于胞浆;抗角蛋白阴性,证实细胞来源于中胚层,符合牙龈成纤维细胞的生物学特征。第四代牙龈成纤维细胞运用MTT法绘制生长曲线结果显示:牙龈成纤维细胞的生长曲线呈典型的“S”形,经历了潜伏期、对数生长期和平台期三个生长阶段。2不同浓度内毒素刺激牙龈成纤维细胞MTT结果显示:与阴性对照组相比,第一天0.1ug/ml组(A)、1ug/ml组(B)、10ug/ml组(C)、100ug/ml组(D)HGF的相对增殖率分别为150±4.18%,127.06±4.23%,100.44±3.78%,72.94±4.42%,A、B、D组与对照组之间有显著性差异(P<0.05),C组与对照组之间无显著性差异(P>0.05),A、B、C与D组比较均有显著性差异(P<0.05),A、B之间无显著差异(P>0.05),A、C,B、C之间均有显著性差异(P<0.05)。第二天结果显示:A、B、C、D组的相对增殖率分别为143.27±3.28% , 112.67±4.06% , 81.12±4.13% ,61.45±4.36%,四组与对照组之间均有显著性差异(P<0.05),A、B,A、B与C,A、B与D之间均有显著性差异(P<0.05)。第一天与第二天同一浓度相比较,A、B、D组无显著性差异(P>0.05),C组有显著性差异(P<0.05)。第四天、第六天、第七天结果显示四组增殖率均逐渐降低且呈浓度依赖关系,即内毒素浓度越大,HGF增殖率越低,低浓度组随着时间的延长,也由对HGF的刺激生长转为抑制,但各浓度组HGF的生长趋势与阴性对照组大致相似。3细胞免疫组织化学方法检测牙龈成纤维细胞在内毒素刺激下不同时间段MMP-1、MMP-3表达量的结果显示:MMP-1抗体主要在牙龈成纤维细胞的胞浆表达,在0h,4h,8h,12h的组化评分分别为0.006,0.35,1.14,2.28,表达趋势逐渐增强,在12h时达到顶峰,以后表达逐渐减弱,24h的组化评分为0.12。MMP-3抗体表达部位与MMP-1类似,也主要在牙龈成纤维细胞的胞浆表达,在0h,4h,8h,12h,24h的组化评分分别为0.002,0.29,1.10,2.13,0.007,可见表达趋势与MMP-1基本类似,在0h-12h之间表达趋势逐渐增强,12h时达到顶峰,以后表达量逐渐减弱,但在同一时间段内MMP-3的表达较MMP-1弱,因而就总体来说,MMP-3表达量较MMP-1少。结论:1体外成功培养了人牙龈成纤维细胞,采用改良酶消化+组织块法进行牙龈成纤维细胞的原代培养与传统的单纯组织块法培养技术相比其成功率显著提高。2内毒素可影响牙龈成纤维细胞的增殖活性:低浓度时可促进其增殖,而高浓度组则对其有毒性作用,抑制其增殖,且随着时间延长抑制率越来越高,此外低浓度组随着时间的延长也对其表现出细胞毒性作用,抑制其生长。3牙龈成纤维细胞在正常情况下可表达少量的MMP-1, 3,受内毒素刺激后表达基质金属蛋白酶-1, 3的量显著增多,其表达趋势基本一致,在12h内逐渐增多,至12h时达到顶峰,后逐渐减弱,但MMP-3的整体表达较MMP-1弱。