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罗非鱼具有生长速度快、耐受性强、适应范围广等特点,是我国南方地区的主要淡水养殖鱼类和主要的出口创汇农产品,然而近年来因无乳链球菌感染引发的链球菌病对我国南方罗非鱼养殖造成巨大威胁,迄今仍缺乏安全高效的防治药物。中草药提取纯化的天然化合物具有毒副作用小、残留风险低、环境污染小、不易产生耐药等优势,近年来中草药作为有效药物广泛用于水产养殖病害防治中。为此,本文以不同来源的5株无乳链球菌为供筛菌株,从40种有抗菌活性的天然化合物中快速筛选对无乳链球菌β-溶血/溶细胞和透明质酸酶毒力因子有抑制作用的天然化合物。采用微孔板法考察40种天然化合物对5株无乳链球菌供试菌株溶血活性的影响,结果显示,马钱子碱、异阿魏酸、白桦酯酸、东莨菪内酯、香豆素、盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素、黄连碱、丹参酮I、单宁酸、槲皮素、杨梅素、鞣花酸、黄芩苷、齐墩果酸、莽草酸、连翘苷、柠檬苦素、芹菜素、山梨酸、吴茱萸次碱、山根碱和龙胆碱共26种天然化合物对]株以上供试菌的β-溶血/溶细胞活性具有抑制作用。其中,4μg/mL黄芩苷对5株供试菌β-溶血/溶细胞活性均具有抑制作用,抑制率为22.11%～84.54%,对无乳链球菌PBSA0901β-溶血/溶细胞活性半数抑制浓度(IC500)为5.39±0.55 μg/mL,且黄芩苷处理过的无乳链球菌连续传代10代,其β-溶血/溶细胞活性仍未能恢复。使用同样的检测方法绘制黄芩苷浓度与抑制率的关系曲线,确定黄芩苷抑制无乳链球菌β-溶血/溶细胞活性的最佳浓度为39.06 μg/mL。使用牛津杯法考察40种天然化合物对无乳链球菌PBSA0901透明质酸酶活性的影响,结果显示东莨菪内酯、大黄酸、大黄酚、黄藤素、柠檬苦素、山梨酸、吴茱萸碱、药根碱、龙胆酸、和柠檬酸均对无乳链球菌PBSA0901的透明质酸酶活性抑制,且抑制率在40%以上。其中,4μμg/mL黄芩苷对无乳链球菌PBSA0901的透明质酸酶活性抑制率为100%。使用全自动生长曲线仪检测39.06 μg/mL黄芩苷对无乳链球菌PBSA0901生长无影响。与39.06μg/mL黄芩苷共培养后的无乳链球菌,分别接种到含有2.5、5、10、20、40 mmol/mL的H202或250、500、1000、2000 μg/mL的溶菌酶的培养基中,结果显示39.06 μg/mL黄芩苷处理后的无乳链球菌PBSA0901在10、20、40 mmol/mL的H2O2培养基中的生长速率μ比对照组显著降低,而在不同浓度溶菌酶的μμ与对照组无显著差异。根据实验罗非鱼体重按1.78×109 CFU/kg剂量腹腔注射接种无乳链球菌PBSA0901,2 h后按鱼体重3%分别连续拌料投喂含0.226、0.445、0.890、1.780和3.560g/kg黄芩苷的饲料,连续投喂含药饲料14 d,在此期间持续观察,结果上述各组对实验罗非鱼的相对保护率依次分别为25.81、41.94、70.97、87.10、90.32%,其半数有效剂量(EC50)为0.526 g/kg。黄芩苷对罗非鱼的急性毒性的研究结果表明,以2000 mg/kg黄芩苷灌胃罗非鱼后,罗非鱼在观察期内存活率为100%,未出现中毒症状,符合Guideline for testing of chemicals药物对靶动物的安全标准。黄芩苷(0.4 mg/mL,0.1 mL/35 g)单次灌胃罗非鱼,分别在0h、0.25 h、0.5h、1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、96 h随机采集罗非鱼6尾,抽取血液,解剖取脑、肝脏、脾脏、头肾、肌肉和胆汁,经高效液相色谱检测血液和各脏器中黄芩苷的浓度,采用房室二室模型和非房室模型进行分析,结果显示黄芩苷在血液中的半衰期(t1/2)为 180.940 h、最高峰时间(tmax)为 0.987 h,最高峰面积(Cmax)为 31.278 μg/mL,药时曲线下面积(AUC)为2252.289 μg/mL·h,表观分布容积(Vd)为0.005;黄芩苷在脑、肝脏、头肾和胆汁中t1/2分别为8.315、38.168、57.273和72.705 h,黄芩苷在脑、肝脏、头肾、肌肉和胆汁中tmax分别为8、8、8、1和12 h,Cmax分别为29.787、39.971、85.577、55.771μg/kg 和 63.038 μg/mL,芩苷在脑、肝脏、头肾和胆汁中 AUCo-∞分别为435.660、2796.590、5667.352和4937.360μg/mL.h。表明对罗非鱼灌胃黄芩苷后,黄芩苷可快速吸收进入血液及肌肉组织,并可通过血脑屏障进入脑组织;黄芩苷吸收进入肝脏和胆囊后,可再由胆汁分泌进入消化道,重吸收入血并因此产生双峰现象,最终通过尿液和粪便排泄消除。黄芩苷在实验鱼类各组织器官的最大分布量由高至低依次为肌肉>头肾>胆汁>肝脏>脑,其在各组织器官的滞留时间由长至短分别为肌肉>胆汁>头肾>肝脏>脑,其在各组织器官滞留的时间越久,可持续发挥药效的时间越长。本研究筛选出的黄芩苷对无乳链球菌的β-溶血/溶细胞活性和透明质酸酶活性的抑制显著,能够影响传代后的/β-溶血/溶细胞活;与黄芩苷共培养后的无乳链球菌在面对H202刺激的时候,表现得更加敏感;拌料投喂感染无乳链球菌疾病的罗非鱼,罗非鱼的存活率明显提升;作为水产养殖用药黄芩苷表现出可靠的安全性和持久性。本研究的结果为水产养殖中无乳链球菌疾病的防治提供新的用药选择,也为中药在水产养殖中的应用提供依据。