论文部分内容阅读
抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）是一种新兴的污染物，对全球人类健康构成潜在威胁。家禽家畜的集约化饲养是造成ARGs不断增加环境负担的主要因素。虽然我国畜牧业大量使用抗生素导致耐药菌的不断增加，但对养殖场相关的ARGs的流行情况仍缺乏本底数据。1.鸡肠道菌耐药基因的宏基因组分析本研究利用Illumina高通量测序调查蛋鸡和肉鸡肠道菌群中ARGs的多样性和丰富性。宏基因组数据分析表明，在细菌门水平上，变形菌、硬壁菌、拟杆菌和放线菌在鸡肠道菌中占主要优势。在细菌属水平上，大肠杆菌的丰度相对较高，并且其中携带着大量质粒。在两组菌群中都发现有编码抗生素耐药性的基因。针对ARDB进行BLAST分析进一步揭示，在两组菌群中共包含195种ARGs，涵盖了目前已知的主要抗生素耐药类型。reads分析表明蛋鸡和肉鸡菌群在耐药基因的丰富性上存在差异，蛋鸡粪便携带的ARGs种类显著高于肉鸡粪便。此外，万古霉素耐药基因（van）在肉鸡粪便菌群中的丰度相对更高。编码β-内酰胺类耐药基因在鸡粪便样品中的含量相当丰富，其中A类β-内酰胺酶基因（bl2e_cbla）在肉鸡粪便中含量最丰富，但蛋鸡粪便中不存在该基因。2．鸡源大肠杆菌的抗生素敏感性检测食品动物携带产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠杆菌是人群感染大肠杆菌的潜在来源。本研究分离鸡源大肠杆菌，对其耐药性进行研究。2011年2月-2013年10月，从位于我国黑龙江、辽宁、吉林和江苏省的20个养鸡场以及3个活禽市场共分离鉴定195株大肠杆菌。根据BD PhoenixTM-100System分析获得这些菌株表现出对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、复方新诺明、氯霉素、左氧氟沙星和四环素的敏感性。最初由BD PhoenixTM-100System初筛ESBL型菌株，进一步由CLSI推荐的头孢他啶与头孢他啶加克拉维酸、头孢噻肟与头孢噻肟加克拉维酸的双纸片确证试验检测ESBLs。结果显示195株大肠杆菌均为ESBL型。抗生素敏感试验显示195株大肠杆菌对氨苄西林、哌拉西林和头孢唑林完全耐药，而对头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、氨苄西林-舒巴坦、头孢他啶、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦的耐药菌株分别为97.9%、80.0%、56.4%、34.3%、13.8%、4.1%和1.5%。一些菌株同时对其它抗生素，如四环素（92.3%）、复方新诺明（89.7%）、环丙沙星（80.5%）、氯霉素（76.9%）、左氧氟沙星（72.8%）、庆大霉素（57.2%）和阿米卡星（11.7%）耐药。195株鸡源大肠杆菌都对亚胺培南和美罗培南敏感。此外，96.9%（189/195）产ESBLs大肠杆菌为多重耐药菌株（multi-drug resistant，MDR）。3．β-内酰胺酶基因的检测本研究检测并鉴定的β-内酰胺类耐药基因包含blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaOXA、blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC、blaEBC和blaFOX。在上述195株鸡源大肠杆菌中，有191株至少携带一种bla基因，其中有183、121、47、2和1株大肠杆菌中检测到blaCTX-M、blaTEM-1、blaOXA、blaSHV-5和blaFOX-8基因。本研究首次在我国鸡源大肠杆菌中检测到blaSHV-5。最常见的blaCTX-M为blaCTX-M-15（68株）、blaCTX-M-65（41株）、blaCTX-M-55（35株）、blaCTX-M-14（32株），其次为blaCTX-M-3、blaCTX-M-13、blaCTX-M-79和blaCTX-M-101，以及嵌合基因blaCTX-M-64、blaCTX-M-123和blaCTX-M-132。按地域归类，在东三省最常见的blaCTX-M基因亚型为blaCTX-M-1（566/145株），在江苏省最常见的blaCTX-M基因亚型为blaCTX-M-55（25/50株）。在195株产ESBLs大肠杆菌中，有15株（7.7%）同时携带CTX-M-1群和CTX-M-9群基因。对blaCTX-M型基因上下游序列分析显示，198个blaCTX-M中有162个（81.8%，162/198）基因上游存在ISEcp1，与CTX-M-9群基因的间隔区域为42bp，而与CTX-M-1群基因间隔区域在45~127bp之间。在多数CTX-M-1群（90.3%，112/124）和CTX-M-9群（75.7%，56/74）基因的下游检测到了orf477和IS903。这说明插入元件（ISs）在blaCTX-M的传播中扮演着重要角色。4．接合实验和质粒分析随机挑选45株产blaCTX-M分离株，通过滤膜接合法进行接合实验，选用叠氮钠抗性的大肠杆菌J53作为受体菌。在含头孢噻肟（4μg/ml）和叠氮钠（200μg/ml）双抗胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）上筛选接合子。结果表明，有37株携带blaCTX-M基因的大肠杆菌的blaCTX-M基因被转移至受体菌，表明多数blaCTX-M型基因都位于接合质粒上。在本研究中，氯霉素和四环素耐药性与CTX-M-1群基因可发生共转移；而庆大霉素、复方新诺明、氯霉素和四环素耐药性与CTX-M-9群基因可发生共转移，表明相应的耐药机制可水平转移并且与CTX-M-1和CTX-M-9基因毗邻。但与携带CTX-M-1群的菌株相比，携带CTX-M-9群的菌株对非β-内酰胺类抗生素耐药更为频繁。blaCTX-M基因可由多种可转移的质粒所携带。5．分子流行病学分型195株产ESBLs大肠杆菌可分为5个系统进化群。A群占优势（35.4%，69/195），其次是D群（34.9%，68/195）、B2群（15.4%，30/195）、B1（群10.8%，21/195）和未知群（3.5%，7/195）。值得注意的是，在粪便大肠杆菌分离株中A群占优势，而在肝脏和鸡肉分离株中D群占优势。45株大肠杆菌的PFGE类型显示34种不同的PFGE图谱。大部分菌株呈现唯一的PFGE图谱，表明这些菌株不太可能形成克隆流行。上述45株携带blaCTX-M大肠杆菌的MLST分型多达28种。尽管没有检测到ST131，但却发现6株携带ST117，在遗传进化上5株属于D群，1株属于B2群。这些大肠杆菌既是多重耐药菌，同时又属于致病菌，可能会对动物生产和公共卫生造成更大的危害。