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目的通过研究再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）小鼠模型自然杀伤细胞（nature killer cell,NK）数量、功能,明确NK细胞在AA发病机制中的作用及地位,同时通过分析不同免疫抑制及促造血治疗方案对AA小鼠模型NK细胞及其下游免疫环节的影响,为AA开展新治疗提供理论依据。进一步通过筛选重型再生障碍性贫血（Severe aplastic anemia,SAA）患者NK细胞的差异蛋白表达,探讨NK细胞在AA中发挥免疫调节作用的机制。方法第一部分:构建AA小鼠模型,造模第17天收获小鼠,测血常规,分离右侧股骨做骨髓病理;采用流式细胞术（FCM）、PCR、ELISA等方法检测小鼠外周血NK细胞数量、亚群、功能,髓系树突状细胞（myeloid dendritic cell,mDC）数量及表面协同分子表达,CD8+T细胞数量、功能,调节性T细胞（Tregs）数量及功能,血浆IFN-γ、IL-4水平。提取同源正常小鼠NK细胞回输至AA小鼠体内,观察小鼠症状、体征及免疫指标的变化。第二部分:构建AA小鼠模型,分别给予环孢菌素A（CsA）、艾曲波帕（Elt）、CsA联合Elt、雷帕霉素（RPM）进行药物干预,观察小鼠体重、血象、骨髓细胞计数、骨髓病理、生存期变化,采用FCM等方法检测小鼠NK细胞数量、亚群、功能变化,mDC数量及表面协同分子表达变化,CD8+T细胞数量、功能变化,Tregs数量及功能变化,血浆IFN-γ、IL-4水平变化。第三部分:分选SAA患者及正常对照外周血NK细胞,提取总蛋白,分为SAA组、正常组,标记肽段,进行质谱检测,每组重复两次。采用PD软件（Proteome Discoverer 1.4）筛选,SEQUEST HT搜素,搜索结果与筛选后的谱图进行定量分析。ANOVA方差分析评估结果差异性,选取p<0.05,ratio≥1.2或ratio≤0.83的蛋白为差异蛋白。结果第一部分:成功构建AA小鼠模型,AA组小鼠体重、血象、骨髓细胞计数均明显低于正常组（NC组）。应用FCM、PCR、ELISA检测AA小鼠及正常小鼠细胞免疫状态。结果显示,AA组与NC组相比,CD8+T细胞比例（52.23±6.45%vs 37.67±7.95%）、穿孔素（perforin）mRNA相对表达水平（1.78±0.15 vs1.15±0.22）、颗粒酶（GB）mRNA相对表达水平（1.81±0.16 vs 1.08±0.15）、mDC表面CD86表达水平（9.15±2.85%vs 6.18±2.10%）、CD80表达水平（18.09±3.39%vs 14.62±3.61%）均明显升高,Tregs比例（4.80±2.07%vs 6.70±2.43%）、Tregs表面CTLA-4表达水平（15.13±4.80%vs 19.26±4.66%）均明显下降,差别均有统计学意义（p<0.05）。AA小鼠NK细胞比例（0.59±0.37%vs 3.38±0.49%）、调节性NK细胞比例（2.79±2.54%vs 24.57±4.56%）较NC组明显下降,功能性NK细胞比例（77.93±11.45%vs 49.92±6.48%）、调节性NK细胞表面NKG2D表达水平（87.14±6.26%vs 76.89±10.02%）、功能性NK细胞表面NKG2D表达水平（77.50±11.10%vs 67.03±8.22%）均较NC组明显上升,差别均有统计学意义（p<0.05）。AA小鼠NK数量减少、调节性NK细胞比例降低与疾病严重程度存在一定相关性。NK细胞回输后,NK细胞回输组（NK组）小鼠NK细胞比例（12.61±3.10%vs 0.89±0.54%）、调节性NK细胞比例（26.14±4.98%vs1.66±1.68%）明显高于AA组,差别均有统计学意义（p<0.05）。NK组小鼠Hb（83.50±7.88g/L vs 71.50±7.96 g/L）、RBC(5.17±0.97×1012/L vs 4.08±0.83×1012/L)、PLT（128.50±40.72×109/L vs 76.00±30.59×109/L）、骨髓细胞计数（6.92±1.10×107/L×107/L vs 3.92±0.89）、生存期（52.5天vs 25天）较AA组明显上升,差别均有统计学意义（p<0.05）。NK组较AA组小鼠CD8+T细胞、CD8+T细胞内perforin表达、CD8+T细胞内GB表达、mDC数量、mDC表面CD80与CD86的表达均下降,差别有统计学意义（p<0.05）,而Tregs数量及其CTLA-4表达水平无明显变化（p>0.05）。第二部分:AA小鼠体重、血象、骨髓细胞计数均明显低于NC组,细胞免疫状态明显高于NC组。与AA组小鼠比较,（1）CsA治疗组血象(Hb:89.40±11.61g/L vs 76.30±11.00 g/L;RBC:3.61±0.62×1012/L vs 2.94±0.57×1012/L;PLT:232.10±65.22×109/L vs 91.30±38.52×109/L)及骨髓衰竭状态（3.67±0.62×107/L vs 2.44±0.77×107/L）改善,小鼠90天生存率提高（40%）,CD8+T数量减少（49.05±7.47%vs 68.12±5.81%）,胞内perforin（7.88±2.46%vs 10.53±2.06%）及GB（51.14±8.86%vs 68.71±7.96%）表达下降,mDC表面CD80（15.11±2.85%vs18.54±2.73%）表达下降,Tregs细胞表面CTLA-4（15.34±3.97%vs 12.63±2.68%）表达升高,调节性NK比例上升（12.14±3.44%vs 3.25±1.91%）,差异有统计学意义（p<0.05）。（2）Elt组小鼠Hb（82.60±10.25 g/L）及RBC(3.62±0.44×1012/L)升高,但骨髓细胞计数、生存期及细胞免疫状态较AA小鼠均无明显改善。（3）CsA+Elt组小鼠Hb（99.50±9.13g/L）、RBC(4.11±0.59×1012/L)、PLT（243.70±56.35×109/L）、骨髓细胞计数（4.12±0.76×107/L）均明显升高,90天生存率提高（80%）,调节性NK细胞数量增加（11.20±3.41%）,CD8+T细胞及mDC明显受抑,Tregs数量（6.13±1.72%）及表面CTLA-4表达（16.47±2.59%）均升高（p<0.05）。（4）RPM组小鼠治疗后血象(RBC:3.81±0.24×1012/L,Hb:93.70±10.45 g/L,PLT:255.50±53.10×109/L)、骨髓细胞计数（3.85±0.76×107/L）、90天生存率（80%）明显上升（p<0.05）;功能性NK细胞表面NKG2D表达（68.70±5.50%）下降;其CD8+T细胞数量（50.83±8.28%）、Perforin（6.35±2.49%）及GB（45.92±8.54%）表达均下降（p<0.05）;而Tregs数量（6.84±1.83%）及表面CTLA-4表达水平（17.48±2.43%）明显升高（p<0.05）。第三部分:与正常对照相比,SAA患者NK细胞93组蛋白表达水平存在明显差异,其中上调蛋白48组,包括组蛋白H1.2、组蛋白H1.3、干扰素调节因子1（IRF-1）等;下调蛋白45组,包括肌动蛋白相关复合体（ARP2/3）,组蛋白H3、组蛋白H4、Protein S100 A8、Protein S100 A9等。结论（1）与对照组小鼠相比,AA小鼠模型中NK细胞数量减少,调节性NK细胞比例降低,NK细胞表面NKG2D表达升高。NK细胞回输后,AA小鼠NK细胞缺乏的状态改善,调节性NK细胞比例恢复,细胞免疫的亢进状态受到抑制,改善了AA小鼠病情。提示NK细胞可能在AA发病中发挥保护性作用。（2）CsA、艾曲波帕、雷帕霉素均可改善AA小鼠模型造血功能,对AA小鼠模型治疗有效。CsA联合艾曲波帕治疗效果最佳,提示二者可能存在协同作用。CsA可以明显升高AA小鼠NK细胞数量及调节性NK细胞比例,对NK细胞功能存在明显影响。雷帕霉素对AA小鼠Tregs有明显扩增作用,并可以改善其功能。CsA、雷帕霉素均可抑制AA小鼠亢进的细胞免疫状态,从而改善小鼠病情,但作用机制可能存在差异。（3）通过蛋白质组学分析发现,SAA患者NK细胞在细胞组分、生物学过程、分子功能方面与正常对照组均存在明显差异。SAA患者NK细胞的胞吞作用、FC-γ受体介导的吞噬作用相关蛋白明显下调。