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在动物的体细胞克隆过程中,重编程不完全是阻碍克隆胚胎发育的主要原因。为降低克隆胚胎DNA甲基化水平,提高克隆胚胎的重编程效率,建立优化广西德保黑猪手工克隆(pig-HMC)技术体系,本研究应用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理广西德保黑猪成纤维细胞细胞以及手工克隆重构胚,并对供体细胞增殖和染色体倍性等进行检测分析,胚胎发育率的统计分析,并对处理后胚胎甲基化等相关基因表达模式进行了分析。1.探讨了5-Aza-CdR处理德保黑猪耳成纤维细胞的适宜浓度.本研究采用不同浓度(0μmol·L-1、0.25μmol·L-1、0.5μmol·L-1和1μmol·L-1)5-Aza-CdR处德保黑猪耳成纤维细胞,发现0.25μmol·L-1处理组细胞生长曲线最相近于对照组,且各处理组细胞生长曲线均呈“S”型。随着5-Aza-CdR浓度增加,细胞均有不同程度的畸变、生长抑制甚至致死。在0μmol·L-1～0.5μmol·L-1处理浓度范围内,5-Aza-CdR处理对德保黑猪成纤维细胞的处理不会显著改变其细胞染色体整倍性。相对表达量分析显示5-Aza-CdR的处理不同程度下调了德保黑猪耳成纤维细胞中Dnmt1、Tet1、Tet2和Tet3的表达,其中对Dnmt1、Tet1和Tet3表达量的下调呈剂量相关。2.探讨了5-Aza-CdR处理对德保黑猪供体和重构胚后对胚胎体外发育潜能的影响。结果发现以不同浓度5-Aza-CdR处理的德保黑猪耳成纤维细胞为供体,各处理组之间的卵裂率和桑椹胚率不存在显著差异,而0.25μmol.L-1和0.5μmol.L-1处理组能有效提高猪HMC囊胚率,0.5μmol.L-1处理组能够显著提高囊胚细胞数。不同浓度5-AzA-CdR处理pig-HMC重构胚能提高重构胚的分裂率、桑椹胚率,20nmol.L-1组能显著提高囊胚率,10nmol.L-1和20nmol.L-1组显著提高囊胚细胞数。利用20nmol.L-15-AzA-CdR在不同时间(24h,48h,72h,96h)里处理pig-HMC重构胚,能有效提高其重构胚的分裂率、桑椹胚率,72h处理组显著提高囊胚率和囊胚细胞数。利用最佳浓度和时间同时处理供体和重构胚对各处理组重构胚发育潜能没有促进作用。3.本研究还探讨了5-Aza-CdR处理后的重构胚中表观遗传修饰相关基因的表达模式与胚胎发育潜能之间的关系。经QRT-PCR检测5-Aza-CdR处理后手工克隆胚胎中基因Dnmt1、Tet1、Tet2、Tet3、Oct4和Nanog mRNA的相对表达情况,结果显示：5-Aza-CdR单纯处理重构胚时,1-cell阶段Tet1、Oct4和Nanog的表达均上调,而Dnmt1、Tet2和Tet3表达下调。2-cell时期Dnmt1、Tet2、Tet3和Oct4的表达均上调,而Tetl和Nanog表达下调；最后到了囊胚时期除了Tetl表达变为上调,Oct4表达变为下调外,其它基因表达情况与2-cell时期一致。同时将供体和重构胚处理后,1-cell时期Dnmtl、Tetl和Tet3的表达上调,而Tet2、Oct4和Nanog表达均下调；2-cell时期检测结果显示所有基因表达均下调；最后到了囊胚时期Tet2、Oct4和Nanog表达变为上调外,其它基因表达情况与2-cell时期一致。结论：分别应用0.25μmol·L-15-Aza-CdR处理供体细胞和20nmol·L-15-Aza-CdR处理重构胚72h,可以降低德保黑猪HMC胚胎DNA甲基化水平并提高其胚胎发育潜能。