颞下颌关节(Temporomandibular joint,TMJ)是颌面部唯一同时具备转动和滑动运动的左右联动关节,参与了咀嚼、吞咽、言语、表情和呼吸等精细且复杂的功能活动。骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是关节疾病中的典型代表,其发病率高,对人体危害大,严重影响了患者的生活质量。虽有不少学者对这类关节疾病进行了相关研究报道,但目前对骨关节炎,尤其是颞下颌关节骨关节炎(Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ-OA)复杂的病理机制尚缺乏完整认识。以往的研究表明,miR-140-5p在软骨细胞分化和软骨内稳态过程中发挥着重要的作用,miR-140-5p基因敲除鼠会出现增龄性骨关节炎的症状。然而,临床研究却发现骨关节炎患者的关节软骨中miR-140-5p表达显著增加。虽然越来越多的研究认为miR-140-5p与OA关系密切,但其功能作用至今仍存在争议。有关miR-140-5p在OA,尤其在TMJ-OA中的作用机制亟需被阐明。本研究第一部分通过建立炎症微环境体外实验模型,模拟了 TMJ-OA样病损改变。第二部分探索了 miR-140-5p的作用靶点,并在炎症微环境中的髁突软骨细胞进行验证。第三部分通过靶向沉默Smad3,进一步阐明miR-140-5p的信号调控网。研究结果探讨了炎症微环境下miR-140-5p调控软骨细胞增殖、分化相关的机制,为TMJ-OA的发生、发展及临床治疗提供重要的参考。第一部分炎症微环境对下颌髁突软骨细胞及胫骨生长板软骨细胞生物学特性的影响[目 的]建立下颌髁突软骨细胞及胫骨生长板软骨细胞炎症微环境体外实验模型,探索不同类型软骨细胞在炎症微环境中的生物学差异。[方 法]1.通过二步酶消化法提取原代下颌髁突软骨细胞及胫骨生长板软骨细胞,采用HE染色法及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色进行细胞来源鉴定。2.通过CCK-8检测两种细胞的细胞增殖率并描绘生长曲线。3.利用IL-1β诱导刺激下颌髁突软骨细胞与胫骨生长板软骨细胞0 h至24 h,建立不同类型软骨细胞的炎症微环境体外实验模型。采用qRT-PCR或Western blotting检测miR-140-5p、MMP13、Col2a1的表达变化,验证体外实验模型的可靠性并探索最佳实验条件。4.观测炎症微环境对两种软骨细胞的炎症反应相关蛋白NF-κB1以及软骨形成分化相关蛋白 Smad3/4、p-Akt1、Runx2、p-CREB、Sox9、TGF-β3 蛋白表达水平的影响,并进行对比研究。[结 果]1.所提原代细胞经免疫细胞化学染色,结果显示Ⅱ型胶原蛋白表达阳性,表明所提取的原代细胞具有软骨细胞的特异性表征,原代软骨细胞的提取方法可靠。2.CCK-8检测结果提示,在培养第5天开始胫骨生长板软骨细胞的光密度值较下颌髁突软骨细胞的光密度值大,差异具有统计学意义。3.qRT-PCR检测结果表明,随着IL-1β诱导刺激时间延长,MMP13以及miR-140-5p的表达逐渐升高,且在诱导24小时差异最显著。相反,Col2a1的mRNA表达水平下降。4.Western blotting检测发现,两种软骨细胞在IL-1β诱导的炎症微环境下,Col2a1蛋白表达降低而NF-κB1蛋白表达升高,提示IL-1β可促进软骨细胞的炎症反应;而软骨细胞增殖、分化相关蛋白 Smad3/4、p-Akt1、Runx2、p-CREB、Sox9、TGF-β3的表达降低,提示软骨细胞的增殖、分化、表型维持等受到影响。值得注意的是,当对比研究两种软骨细胞在炎症微环境中软骨形成相关蛋白表达差异时发现,下颌髁突软骨细胞的TGF-β3蛋白减少程度较胫骨生长板软骨细胞更明显,而p-Akt1蛋白水平的表达降低程度则在胫骨生长板软骨细胞内表现更加显著。[结 论]1.二步酶消化法提取的原代软骨细胞来源可靠,重复性好。2.胫骨生长板软骨细胞的增殖能力较髁突软骨细胞强。3.IL-1β诱导刺激24 h是较理想的炎症微环境实验条件。4.IL-1β可促进炎症反应,影响软骨细胞的增殖、分化。5.尽管不同部位关节软骨细胞在炎症微环境中的表现略有差异,但总体上都表现出相似的OA病理改变,提示IL-1β诱导MCCs的体外模型同样可具有类似TMJ-OA样的病损改变。第二部分miR-140-5p在TGF-β通路中的作用靶点验证[目 的]预测miR-140-5p在TGF-β通路中潜在的靶基因结合位点,并进行验证。探索炎症微环境下,IL-1β介导miR-140-5p通过TGF-β信号通路对下颌髁突软骨细胞的增殖、分化、凋亡相关蛋白进行调控的机制。[方 法]1.对miR-140-5p与Smad3、Smad4 的 3’非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)潜在结合位点进行预测。在野生型(wide-type,WT 3,UTR)质粒载体的模板基础上,将靶序列进行突变(mutant-type,MUT3’UTR)后与相应的negative control共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶试验进行靶基因验证。2.通过miR-140-5p mimics/inhibitors转染下颌髁突软骨细胞,伴有或不伴有IL-1β诱导刺激,建立炎症微环境下的miR-140-5p转染实验模型。采用Western blotting分别检测转染0 h～72 h靶蛋白的表达变化,探索理想的转染条件。3.qRT-PCR检测miR-140-5p miRNA表达变化,验证转染模型的可靠性。4.免疫荧光染色分析目的蛋白Smad3的表达变化,在下颌髁突软骨细胞中验证miR-140-5p对Smad3蛋白表达的靶向调控作用。5.通过所建立的炎症微环境转染模型,使髁突软骨细胞内miR-140-5p过表达。Western blotting检测分析Smad3/4、p-Akt1、Runx2、p-CREB、Sox9、TGF-β3、NF-κB1、NF-κB2、RelA等软骨增殖、分化、凋亡相关蛋白的表达变化,阐明炎症微环境中miR-140-5p与TGF-β通路之间的调控关系。[结 果]1.通过TargetScan及miRTarBase软件进行预测,发现Smad3/4的mRNA3’UTR上含有与miR-140-5p结合的潜在序列。双荧光素酶试验发现,与NC相比,miR-140-5p对Smad3野生型载体报告荧光有所下调,突变型载体的报告荧光有所回复,差异具有统计学意义。而miR-140-5p对Smad4野生型载体报告荧光无明显影响。双荧光素酶验证结果说明Smad3是miR-140-5p的直接作用靶点,而Smad4的3’UTR上的预测位点与miR-140-5p没有明显的相互作用。2.Western blotting 分析结果提示,miR-140-5p mimics 或 miR-140-5p inhibitors 转染下颌髁突软骨细胞可抑制或升高Smad3的蛋白表达水平,且在转染48 h作用最明显。3.qRT-PCR结果显示,miR-140-5p mimics转染后,可明显升高下颌髁髁突软骨细胞内的miR-140-5p表达。miR-140-5p inhibitors可降低miR-140-5p的表达,且能拮抗IL-1β对miR-140-5p的诱导作用,提示所建转染模型可靠。4.通过免疫荧光染色分析结果表明,与对照组(NC)相比,miR-140-5p mimics或IL-1 β均可降低Smad3的荧光强度,联合作用时抑制作用更明显。而miR-140-5p inhibitors可上调Smad3的荧光表达,并拮抗IL-1β对Smad3的抑制作用。5.Western blotting检测结果表明,IL-1β可通过miR-140-5p抑制软骨细胞增殖相关蛋白Smad3/4、p-Akt1,降低了软骨聚集肥大相关蛋白Runx2表达,减少了软骨表型维持相关蛋白Sox9、p-CREB、TGF-β3的表达。miR-140-5p抑制了 NF-κB1、NF-κB2、RelA蛋白表达水平。值得注意的是,与单独的miR-140-5p mimics转染组作对比时,miR-140-5p mimics联合IL-1β作用后并未表现出对Smad3/4、p-CREB和Sox9有更强的抑制效果,这提示IL-1β可能直接通过miR-140-5p对Smad3/4、p-CREB 和 Sox9 进行负向调控。而 miR-140-5p mimics 联合 IL-1β 共同作用于下颌髁突软骨细胞后,对p-Akt1、Runx2、TGF-β3可表现出更加明显的负调节结果,提示了 IL-1β除了通过介导miR-140-5p外,还可能通过其他途径对 p-Akt1、Runx2、TGF-β3 进行调控。[结 论]1.Smad3是miR-140-5p在TGF-β通路中的直接作用靶点之一。2.IL-1β诱导的炎症微环境中,miR-140-5p可对Smad3进行靶向调控。3.炎症微环境下miR-140-5p调控软骨细胞增殖、分化、凋亡相关蛋白的信号机制,可能与TMJ-OA病理机制有关。第三部分miR-140-5p通过TGF-β/Akt/NF-κB信号通路参与调控软骨细胞的增殖、分化、凋亡[目 的]阐明miR-140-5p靶向调控Smad3的信号机制,探索可能参与miR-140-5p调节软骨增殖、分化、凋亡的信号调控网。[方 法]1.建立Smad3表达沉默的软骨细胞体外模型,将Smad3的小干扰RNA 片段(Small interfering RNA,siRNA)分别与 miR-140-5p mimics 以及对应的negative control共转染下颌髁突软骨细胞。Western blotting观测Smad3、p-Smad3蛋白表达变化,以验证转染模型可靠性。2.利用CCK-8检测转染后软骨细胞在24h、48h、72h时的光密度值,评估miR-140-5p通过抑制Smad3的表达对软骨细胞增殖能力的影响。3.利用流式细胞术观测转染各组下颌髁突软骨细胞的凋亡情况。4.通过Western blotting检测软骨细胞增殖相关蛋白Smad3/4、p-Akt1,软骨细胞分化相关蛋白Runx2,软骨细胞表型相关蛋白Sox9、p-CREB、TGF-β3,凋亡及炎症反应相关蛋白NF-κB1、NF-κB2、RelA的表达变化。[结 果]1.Western blotting结果显示,Smad3沉默组以及mimics转染的miR-140-5p过表达组均可抑制Smad3、p-Smad3的蛋白表达,证明转染模型建立可靠。2.CCK-8结果提示Smad3沉默组以及miR-140-5p过表达组的光密度值较对照组低,且差异具有统计学意义,软骨细胞的增殖能力受到抑制。3.流式细胞术结果显示,过表达miR-140-5p或沉默Smad3均可促进下颌髁突软骨细胞发生凋亡,且共转染组细胞凋亡率的升高最为明显。4.miR-140-5p调控机制涉及TGF-β/Akt/NF-κB通路的参与。Western blotting检测分析结果显示,沉默Smad3或过表达miR-140-5p可抑制细胞增殖相关蛋白Smad3/4、p-Akt1,软骨分化相关蛋白Runx2,表型维持相关蛋白Sox9、p-CREB、TGF-β3的表达。值得注意的是,与对照组negative control相比,沉默Smad3对p-CREB的表达并无明显影响,但只要当miR-140-5p过表达时,p-CREB的表达均降低,且差异具有统计学意义。这提示p-CREB可能是miR-140-5p的直接作用位点。沉默Smad3与miR-140-5p过表达联合作用时p-Akt1、Runx2、Sox9、TGF-β3的表达下调更加明显,提示除Smad3外,miR-140-5p可能通过其他途径实现对p-Akt1、Runx2、Sox9、TGF-β3的负向调控。过表达miR-140-5p时,细胞凋亡相关蛋白NF-κB1、NF-κB2、RelA的蛋白表达减少,而沉默Smad3对凋亡相关蛋白的表达并无明显改变,提示miR-140-5p并非通过Smad3影响NF-κB通路的变化。[结 论]1.miR-140-5p可通过靶向抑制Smad3的表达,从而影响下颌髁突软骨细胞的增殖、分化、凋亡相关蛋白的表达。2.miR-140-5p的调控机制错综复杂,诸多信号通路牵涉其中,包括了 TGF-β/Akt/NF-κB信号通路。3.miR-140-5p可能是潜在的TMJ-OA早期病损的指标。