瑞香狼毒根乙醇提取液对寄生水霉生长影响的初步研究

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寄生水霉常引起多数淡水鱼类和鱼卵患水霉病,导致鱼类大量死亡,严重影响了水产养殖业的健康发展。目前对于已经发生水霉病的水产养殖动物,并没有理想的治疗药物。瑞香狼毒、月腺大戟根具有广泛的抑菌活性,但在抑制寄生水霉方面还没有相关研究。为探究瑞香狼毒、月腺大戟根对寄生水霉生长的影响,本研究采用超声辅助系统溶剂提取法制备了两种常用狼毒根的提取液,比较了两种常用狼毒根的提取液对寄生水霉的最低抑菌浓度,筛选出瑞香狼毒乙醇提取液为最佳提取液;进一步研究了瑞香狼毒乙醇提取液对寄生水霉菌丝生长、孢子萌发率、菌丝形态及超微结构的影响,并通过模拟治疗过程探究了瑞香狼毒乙醇提取液对鲫鱼寄生水霉病的治疗效果。1.从患病鲫鱼身上分离出一株水霉菌,通过纯化培养,经形态学、分子生物学鉴定出该菌株为寄生水霉菌(Saprolegnia parasitica)。2.根据溶剂极性大小,用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水5种溶剂组成溶剂系统,采用超声技术分别提取了瑞香狼毒、月腺大戟根部有效成分。结果显示,水溶剂对月腺大戟的提取率最高为21.38%,丙酮溶剂对月腺大戟的提取率最低为0.98%,石油醚、乙酸乙酯、乙醇溶剂对月腺大戟的提取率分别为:2.19%、1.91%、1.51%;乙酸乙酯溶剂对瑞香狼毒的提取率最高为12.03%,石油醚对瑞香狼毒的提取率最低为0.50%,丙酮、乙醇、水溶剂对瑞香狼毒的提取率分别为:4.22%、1.45%、3.26%。3.采用微量稀释法分别测定石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水5种溶剂提取液对寄生水霉孢子的最低抑菌浓度,其中月腺大戟不同溶剂提取液的最低抑菌浓度为2.5mg/mL,最佳提取溶剂为乙醇;瑞香狼毒不同溶剂提取液的最低抑菌浓度为0.15625mg/mL,最佳提取溶剂为乙醇。4.通过测定瑞香狼毒乙醇提取液对寄生水霉菌丝生长的影响,发现试验组菌落生长直径显著低于空白对照组(P<0.05)。瑞香狼毒乙醇提取液浓度为0.3125mg/mL时,对寄生水霉菌丝生长抑制率达100%,毒力回归方程Y=3.1503X+9.9012,EC50为0.02781mg/mL,瑞香狼毒乙醇提取液对寄生水霉的抑制作用接近亚甲基蓝对水霉菌的抑制作用。20℃培养24h,空白对照组寄生水霉孢子平均萌发率为86.67%;0.625mg/mL瑞香狼毒乙醇提取液处理组,寄生水霉孢子萌发率为0.00%,回归方程为Y=290.45X2—304.45X+78.106。光学显微镜观察发现,试验组寄生水霉菌丝体染色不均匀,出现透明现象。扫描电镜观察发现,试验组菌丝体表面粗糙、皱缩。透射电镜观察发现,试验组寄生水霉孢子细胞壁模糊,细胞质电子密度低,细胞内容物少,出现大量空泡,细胞结构被破坏;试验组菌丝体细胞壁模糊、皱缩甚至消失,细胞质电子密度低,细胞内容物少,相邻细胞膜出现部分粘连现象。瑞香狼毒乙醇提取液能通过破坏寄生水霉菌丝、寄生水霉孢子细胞结构有效抑制寄生水霉生长。5.模拟治疗过程对鲫鱼影响的研究中,只有0.625mg/mL组在试验24h,治疗效果显著高于空白对照组(P<0.05)。观察到未感染寄生水霉的试验鱼没有明显不适症状;感染寄生水霉病的试验鱼出现了反应迟缓、游动失衡甚至死亡现象,在死亡的试验鱼眼部观察到点状出血点,与鲫鱼的中毒症状观察试验结果相似。对死亡率统计发现,未感染寄生水霉的试验鱼没有出现死亡情况;感染寄生水霉病的鲫鱼,试验24h,0.625 mg/mL药液浸泡组死亡率显著高于空白对照组(P<0.05);试验48h,药物浓度达到0.15625 mg/mL浸泡组患病鲫鱼死亡率均显著高于空白对照组(P<0.05);试验72h,0.15625 mg/mL、0.625 mg/mL药液浸泡组死亡率显著高于空白对照组(P<0.05)。瑞香狼毒乙醇提取液能对鲫鱼寄生水霉病产生治疗效果,但会导致患有寄生水霉病的鲫鱼出现中毒甚至死亡,从而影响治疗效果。
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