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枯草芽孢杆菌是FDA批准、公认的“GRAS”菌种,其代谢分泌多种对环境和有机体没有危害的生物活性物质,如抗生素,酶类等。Bacillomycin D是由枯草芽孢杆菌非核糖体酶催化合成的一种属于iturin家族的抗菌脂肽。它是由一个亲水性环状七肽和一个疏水性β-氨基脂肪链相连而成的具有表面活性的双亲性环状脂肽。由于其具有安全无毒、抗菌谱广、易被生物降解等特点,在食品、粮食防腐以及医药开发等方面具有广阔的应用前景。野生型菌种的抗菌肽产量较低,以及现有的培养基成本较高,导致生产利润过低,无法应用于工业化生产。本研究以枯草芽孢杆菌fmbJ为研究对象进行菌种改造,通过诱变、基因组改组以期获得高产、稳定遗传的突变菌株。通过对其工业发酵培养基进行优化,进一步提高抗菌肽Bacillomycin D的产量,以便实现工业上的应用。1.通过紫外诱变、亚硝酸胍诱变、常温室压等离子体诱变(ARTP)对枯草芽孢杆菌fmbJ进行处理,选育BacillomycinD的高产菌株。通过计算致死率和正突变率,确定紫外诱变最佳条件:功率20 W,照射距离20 cm,诱变时间60 s;亚硝酸胍诱变最佳条件:亚硝酸胍浓度1.2 mg/mL,处理温度37℃,处理时间10 min;ARTP诱变的最佳条件:入射功率200 W,反射功率40 W,处理温度20℃,通气量10 SLM,载物台与放射源距离10.0 mm,处理时间7 s。通过三种诱变处理,共获得7株Bacillomycin D含量较原始菌株提高的突变菌株,平均提高27.7%。2.对枯草芽孢杆菌fmbJ原生质体制备、再生、灭活及融合条件进行优化,并利用基因组改组技术选育BacillomycinD高产菌株。结果表明,原生质体制备最佳条件为:酶浓度0.07 mg/mL,酶解时间70 s,菌体培养时间8 h,;紫外灭活最佳条件为:功率20 W,照射距离20 cm,照射时间100 min;热灭活最佳条件为:85℃,水浴50 min;原生质体融合最佳条件为:40%PEG6000,37℃水浴融合10 min。在上述原生质体处理条件下,通过对前期诱变筛选到的6株Bacillomycin D高产菌株进行基因组改组,共得到5株高产菌株F131、2F14、2F82、5F1和5F5,Bacillomycin D产量分别达到 441.77 mg/L,487.62 mg/L,458.03 mg/L,500.55 mg/L 和 509.05 mg/L,最高Bacillomycin D产量是原始菌株的1.84倍。3.为降低抗菌肽Bacillomycin D的生产成本,并提高其产量,在单因素基础上采用Plackett-Burman试验,寻找原始培养基6010中对Bacillomycin D产量影响显著的营养因素,并通过Central Composite Design响应面法对发酵培养基配方进行优化。结果表明,影响抗菌肽产量最显著的3个因素为:麦芽糖浆、尿素、MgSO4·7H2O。最佳培养基配方为:麦芽糖浆46 g/L,尿素0.72 g/L,MgSO4·7H2O 0.35 g/L,玉米浆16 g/L、(NH4)2SO43 g/L,K2HP04 7 g/L,MnS04·H20 0.05 g/L。优化后,枯草芽孢杆菌M364 摇瓶发酵 Bacillomycin D 产量达到(620.2±13.9)mg/L,比优化前(415.5±9.8)mg/L提高了 50%,是常用Landy发酵培养基(240±20.6)mg/L的2.6倍;19 L发酵罐中产量为(890.6±20.1)mg/L,较原始6010培养基提高了 1.14倍。