我国是海水养殖大国，海洋贝类的养殖在我国海水养殖业中占有非常重要的地位。栉孔扇贝(Chlamys farreri)和皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)是具有较高经济价值的两种重要海洋贝类。近几年来，我们在国际合作和基金项目的支持下，对栉孔扇贝和皱纹盘鲍等海洋贝类的雌核发育进行了系统研究，探明了雌核发育机理以及雌核发育二倍体诱导的细胞学机制，确立了皱纹盘鲍和栉孔扇贝雌核发育二倍体诱导的有效程序，查清了雌核发育二倍体的生长和存活特点。本研究以这两种贝类为研究材料，开发了栉孔扇贝和皱纹盘鲍的多重PCR扩增体系，用大量的微卫星和AFLP等分子标记研究了这两种贝类雌核发育二倍体的遗传学特性，查清了贝类雌核发育的近交程度，利用雌核发育二倍体家系和两个微卫星连锁图谱上的大部分标记及新筛选标记的半四分体分析，构建了这两种贝类较高密度微卫星-着丝粒图谱，并与遗传图谱进行整合，定位了个连锁群中着丝粒的位置。此外，我们还分析了重要的海水养殖种类刺参的雌核发育二倍体遗传学特性，完成了刺参遗传连锁图谱部分连锁群着丝粒的定位。主要研究结果如下：　　 1.栉孔扇贝微卫星标记多重PCR的开发　　 通过单个微卫星位点的PCR扩增，6％聚丙酰胺变性凝胶电泳检测微卫星的特异性扩增条带，查清各个微卫星位点的最佳PCR扩增条件。挑选引物序列间互不干扰、扩增片段长度不重叠、退火温度接近的2-3个位点进行多元PCR组合的筛选。本实验开发了4组栉孔扇贝高多态性微卫星多重PCR扩增体系，提高了基因分型效率。利用CERVUS3.0软件对12个栉孔扇贝全同胞家系360个子代进行家系鉴定，验证了这4组微卫星多重PCR家系鉴定效率。结果表明，144个基因型数据中4.9％的微卫星位点出现偏分离，无效等位基因出现的频率为14.8％，平均多态信息含量为0.872。家系鉴定分析显示，一组微卫星多重PCR鉴定成功率为75％，两组鉴定成功率达到100％。　　 2.栉孔扇贝雌核发育二倍体遗传学特性研究　　 通过紫外线照射精子并用细胞松弛素B(CB)抑制减数分裂第二极体释放诱导了3个栉孔扇贝雌核发育二倍体家系，研究了27个微卫星位点在3个雌核发育家系中的分离，进行了微卫星-着丝点重组率分析，通过杂合后代的比例计算出重组率y的范围是0.05到0.78，平均值为0.41，发现在栉孔扇贝的某些染色体上存在交叉干涉现象。假设完全干涉的条件下，计算出微卫星-着丝点距离范围是3 cM-39 cM。估算出栉孔扇贝雌核发育子一代的近交系数为0.59。在3个对照组家系中这27个位点全部符合孟德尔遗传规律，其中9个位点存在无效等位基因。而在3个雌核发育组中，在CF01，CF02，CF17和CFMSP009这4个位点发现两类纯合子的比例偏离1:1。分析的所有雌核发育后代都只有母本的等位基因，没有发现父本特异等位基因，说明本实验用的雌核发育子代100％为雌核发育个体。　　 3.栉孔扇贝微卫星标记-着丝粒作图及与遗传图谱的整合　　 着丝粒作图是进一步完善连锁图谱，研究染色体的交叉以及查明减数分裂过程中交叉干涉情况的重要工具。从已发表的栉孔扇贝遗传连锁图谱所有19个连锁群中挑选了137个微卫星标记，利用对照组筛选出90个母本杂合的微卫星标记，研究了这90个微卫星在3个雌核发育二倍体家系中的分离，每个家系60个雌核发育子代，通过半四分体分析，完成了19个连锁群的微卫星-着丝粒作图及与遗传图谱的整合。对照组分析结果显示，90个微卫星位点全部符合孟德尔遗传，而雌核发育组中有4.4％的标记偏离两类纯合子1:1分离比。第二次分裂分离比y值范围是0.033至0.778，平均值是0.332，证实了栉孔扇贝某些染色体中存在交叉干涉现象。发现在至少两个家系有分离的42个标记中有1个在不同家系间有差异，表明个别位点在不同家系间的基因-着丝粒重组率有所差异。着丝粒定位结果基本符合栉孔扇贝染色体核型，但在连锁图谱和着丝粒图谱中发现一些位点顺序有所不同。本研究使栉孔扇贝遗传连锁图谱上的信息更加完善，可作为基因组研究富有信息的工具，并为将来扇贝着丝粒结构和功能的研究奠定基础。　　 4.皱纹盘鲍微卫星标记多重PCR的开发　　 通过对单个微卫星位点的PCR扩增，6％聚丙酰胺变性凝胶电泳检测微卫星的特异性扩增条带，查清了各个微卫星位点的最佳PCR扩增条件。对筛选出的具有清晰扩增产物，特异性好的位点进行位点的组合扩增，通过优化退火温度、反应体系、引物浓度等条件摸索出最佳扩增条件。根据不同微卫星扩增产物的条带亮度，调整引物添加量，最终达到较一致的扩增效率。本实验开发了4组皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)微卫星多重PCR扩增体系，提高了基因分型效率。运用CERVUS3.0软件对12个皱纹盘鲍全同胞家系的372个子代进行家系鉴定，验证了这4组微卫星多重PCR在家系鉴定中的效率，发现有4.9％的微卫星出现偏分离，无效等位基因频率为10.6％，平均多态信息含量为0.82。仅用1组微卫星多重PCR模拟和家系鉴定的成功率分别为86％和90％，两组则达到100％。结果表明，微卫星多重PCR技术能准确地把任意子代鉴定到各个家系，可以满足大批量家系材料的分析，具有较好的应用价值。　　 5.皱纹盘鲍雌核发育二倍体遗传学特性研究　　 利用全基因组扩增技术，对皱纹盘鲍雌核发育二倍体面盘幼虫的DNA进行了基因组扩增，分析了654个AFLP标记的遗传特性，比较了AFLP和微卫星标记在染色体上的分布情况。利用AFLP标记在全基因组水平评价了雌核发育的近交效率以及交叉干涉的频率和强度。所用654个AFLP标记全部符合3:1孟德尔分离比，第二次分裂分离频率y的范围是0.00到0.96，其中23.9％的y值大于0.67，证明皱纹盘鲍中存在交叉干涉现象。654个AFLP标记平均重组率y为0.45，固定指数为0.55，说明减数分裂雌核发育是加快皱纹盘鲍基因纯合程度的有效手段。在完全干涉条件下，AFLP标记-着丝粒遗传距离范围是0.0-47.8 cM。AFLP标记-着丝粒重组率y从0到1均匀分布，且没有发现明显的成簇分布。仅有少量标记(4.4％)重组率y大于0.9，说明皱纹盘鲍的交叉干涉程度较低或为中等水平。本实验首次利用海洋贝类幼虫的全基因组扩增技术实现了贝类幼虫的AFLP标记半四分体分析，研究结果为今后皱纹盘鲍的遗传改良和选择育种计划提供了重要参考。　　 6.皱纹盘鲍微卫星标记-着丝粒作图及与遗传图谱的整合　　 利用紫外线照射精子并用细胞松弛素B(CB)抑制第二极体排放构建了2个皱纹盘鲍第二极体抑制型雌核发育二倍体家系，从皱纹盘鲍微卫星连锁图谱上挑选了115个微卫星位点进行引物合成，利用2个家系筛选出母本杂合的微卫星位点97个，仅用符合孟德尔分离规律的微卫星标记进行微卫星-着丝粒作图，通过半四分体分析，定位了18个连锁群着丝粒的位置，实现了着丝粒图谱与遗传图谱的完全整合，并发现了皱纹盘鲍中存在复杂的交叉现象。微卫星一着丝粒重组率范围是0.037至0.950，平均值是0.399，说明存在交叉干涉现象。计算出固定指数为0.6，是一代全同胞交配近交程度的2.4倍，说明雌核发育是加快皱纹盘鲍纯合程度的有效方法。对照组分析结果显示，97个微卫星位点都符合孟德尔遗传，而雌核发育组中有5.2％的标记偏离两类纯合子1:1分离比。发现了不同连锁群交叉分布不一致现象。着丝粒位置大部分与核型一致，但在连锁图谱和着丝粒图谱中发现个别位点的位置明显不同。通过对LG2连锁群上的4个位点的基因型进行同时检测，进行了皱纹盘鲍染色体的交叉分布研究和连锁分析。雌核发育A家系中共54个个体4个位点的基因型没有缺失，共108条染色体，其中44个无交叉(40.7％)，23个单交叉(21.3％)，37个双交叉(34.3％)和4个三交叉(3.7％)。然而，对LG6上的4个位点的基因型进行同样分析得到了较低的交叉重组率，其中111个无交叉(61.7％)，54个单交叉(30％)，12个双交叉(6.7％)和3个三交叉(1.6％)。结果表明，皱纹盘鲍不同连锁群的交叉频率和交叉分布都有所不同，皱纹盘鲍中存在交叉干涉现象。实验结果中微卫星标记与着丝粒之间相对距离的信息对遗传连锁图谱着丝粒的整合有重要意义。　　 7.刺参雌核发育二倍体人工诱导　　 紫外线照射使精子遗传物质失活，用细胞松弛素B(CB)处理受精卵抑制第二极体释放，诱导刺参雌核发育二倍体。用强度为2561μw/(cm2·s)的紫外线(254 nm)照射不同时间的精子与正常卵子受精。结果发现随照射时间的增加，卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼虫发生率逐渐减低，照射30 s时小耳幼虫发生率降为0。受精后35 min，显微镜下观察到有20～30％受精卵排出第1极体时，用浓度0.5μg/ml的CB持续处理受精卵20 min，诱导出刺参第二极体抑制型雌核发育二倍体，雌核发育二倍体发育速度低于正常二倍体。微卫星分析表明，雌核发育二倍体诱导率为93.3％。　　 8.刺参雌核发育二倍体遗传学特性研究　　 通过紫外线照射使精子遗传物质失活，用细胞松弛素B(CB)处理受精卵抑制第二极体释放，成功诱导出2个刺参雌核发育二倍体家系。选用了43个刺参微卫星标记，通过半四分体分析，利用2个刺参雌核发育二倍体家系进行了微卫星-着丝粒作图。对照组分析结果显示，只有1个微卫星位点(2.3％)偏离孟德尔遗传规律，而在雌核发育组中，有2个位点(AH058和AH130)偏离两类纯合子1:1分离比。微卫星-着丝粒重组率范围在0.00至0.80，平均值是0.21，固定指数为0.79。微卫星分析结果表明，刺参中存在较弱的交叉干涉现象。固定指数0.79是一代全同胞交配近交程度(0.25)的3.2倍，说明减数分裂雌核发育可能是刺参快速建立纯系的有效途径。假设完全干涉的条件下，计算出微卫星-着丝点之间的遗传距离范围是0-40 cM。通过半四分体分析，发现了2个与着丝粒紧密连锁的标记，分别是AH028和AH112。本研究定位了2个雄性连锁群LG3和LG20中着丝粒的位置，实现了刺参遗传连锁图谱部分连锁群着丝粒位置的整合。　　 综上，本研究构建了栉孔扇贝和皱纹盘鲍中高密度微卫星-着丝粒图谱，并将微卫星-着丝粒图谱与微卫星连锁图谱进行整合，确定了连锁群中着丝粒位置。本研究进一步改善了现有遗传连锁图谱，为今后开展与物理图谱的整合奠定了重要基础。通过雌核发育二倍体的标记连锁分析，查明贝类连锁群上交换的分布模式以及干涉强度，对于精细遗传图谱的构建，揭示减数分裂中染色体的行为，具有重要的理论与应用意义。