过敏性哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症,在易感者中此种炎症可引起反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状,多在夜间和(或)凌晨发生,气道对多种刺激因子反应性增高。但症状可自行或经治疗缓解。肥大细胞在哮喘发作的病理生理学机制上起着重要的作用。当受到变应原刺激后,肥大细胞会发生脱颗粒,释放大量的内分泌素介质,如组胺,前列腺素D2,白三烯C4等,这些介质会引起支气管收缩,粘液分泌,黏液腺水肿,最终导致支气管发生痉挛,出现可逆性的呼吸困难。研究证实,肥大细胞激活与细胞膜上的一种钙通道——钙释放激活钙通道(calcium release-activated calcium channel, CRAC)密切相关,在受到过敏原刺激后,肥大细胞膜上的CRAC开放,外钙内流引起肥大细胞脱颗粒,多种酶及细胞因子释放,从而引起一系列的病理生理改变。因此,抑制肥大细胞CRAC通道开放,减少活化肥大细胞脱颗粒,是过敏性哮喘的治疗的一个重要靶标。白藜芦醇(Resveratrol, RV)是一种多酚类物质,广泛存在于葡萄、花生等等,具有重要的抗炎抗氧化的作用,对心脏缺血-再灌注损伤、全身性炎症反应等具有良好的治疗作用。最近研究发现,白藜芦醇还具有抑制HMC-1细胞CRAC通道开放的效应,提示RV可能具有抑制肥大细胞脱颗粒,治疗过敏性疾病的作用。虎杖苷(polydatin, PD)是一种白藜芦醇糖苷,结构与功能上与RV非常相似。因此我们研究PD对肥大细胞脱颗粒的调节作用及其钙信号机制,探讨PD对过敏性哮喘的治疗作用。结果如下：一、虎杖苷能够抑制免疫性刺激物激发的RBL-2H3细胞脱颗粒。免疫性刺激物激发的肥大细胞脱颗粒检测：首先在RBL-2H3肥大细胞培养液中加入抗DNP-BSA的IgE,过夜孵育致敏RBL-2H3细胞,然后再加DNP-BSA37℃30min诱导细胞脱颗粒。我们用β-己糖激酶释放法来反映RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。1.虎杖苷以剂量依赖的方式减少免疫性刺激物激发RBL-2H3细胞的脱颗粒。对照组的RBL-2H3细胞受到DNP-BSA刺激后,其细胞内的β-己糖激酶释放率达到56.2%±2.1%(n=40)。PD急性(30 min)或慢性(过夜孵育)作用均不引起肥大细胞的脱颗粒。但是,经急性或慢性虎杖苷预处理后,免疫性刺激物激发的RBL-2H3细胞脱颗粒显著降低,而且随着PD浓度的升高抑制效应逐渐增强。1μM,10μM和100μM虎杖苷急性处理后,RBL-2H3细胞β-己糖激酶释放率依次减少到28.9%±0.9%(n=40,p<0.01 vs对照组),21.8%±1.1%(n=40,p<0.01vs对照组)和16.6%±1.2%(n=40,p<0.01 vs对照组)。与急性虎杖苷处理的结果相类似,,分别以1μM,10μM和100μM虎杖苷慢性处理后,DNP-BSA诱导的RBL-2H3细胞β-己糖激酶释放率依次减少到27.2%±1.1%(n=40,p<0.01 vs对照组),18.7%±1.1%(n=40,p<0.01 vs对照组)和13.9%±1.4%(n=40,p<0.01vs对照组)。2虎杖苷降低了RBL-2H3细胞对免疫性刺激物的敏感性DNP-BSA呈剂量依赖性刺激IgE致敏RBL-2H3细胞脱颗粒。0.25μg/ml, 0.5μg/ml, 1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml浓度下的DNP-BSA所引起的RBL-2H3细胞β-己糖激酶释放率依次为19.6%±2.3%(n=16),25.7%±1.8%(n=16),53.0%±2.1%(n=16),55.5%±2.4%(n=16),和64.0%±3.3%(n=16)；当用10μM虎杖苷处理RBL-2H3细胞后,发现0.25μg/ml,0.5μg/ml, 1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml浓度下的DNP-BSA所引起的RBL-2H3细胞β-己糖激酶释放率依次减少到8.7%±1.0%(n=16,p<0.05 vs对照组),12.6%±1.0%(n=16,p<0.01 vs对照组),33.6%±3.0%(n=16,p<0.01 vs对照组),28.8%±2.4%(n=16,p<0.01 vs对照组),和37.5%±2.3%(n=16,p<0.01 vs对照组)。3.虎杖苷抑制免疫性刺激物引起的钙离子通过CRAC通道内流。我们通过Fluo-4(5μM)的荧光强度来检测胞内的Ca2+浓度,DNP-BSA引起IgE致敏肥大细胞产生Ca2+瞬变,幅度(ΔF／F0)为1.58±0.06(n=22)。虎杖苷处理后,Ca2+瞬变幅度明显降低,ΔF／F0为0.61±0.05(n=51,p<0.01 vs对照组).对Ca2+瞬变动力学分析发现,PD延长Ca2+瞬变达到峰值的时间(TTP),缩短Ca2+瞬变50%衰减的时间(T0.5)。对照组TTP和T0.5分别为128.11±6.05(n=22)和616.61±13.15(n=22).经虎杖苷处理后,RBL-2H3细胞胞内Ca2+浓度到达峰值的时间(TTP)延长至212.24±5.07(n=51,p<0.01 vs对照组),RBL-2H3细胞胞内Ca2+浓度降低50%所需的时间(T0.5)缩短至372.61±6.45(n=51,p<0.01 vs对照组)。当移除细胞外液中的2mM Ca2+时,胞内Ca2+浓度的升高完全依赖于胞内的释放,虎杖苷对胞内Ca2+浓度升高无明显抑制,说明虎杖苷主要通过减少胞外Ca2+通过CRAC通道内流来减少免疫性刺激物引起的Ca2+瞬变。大量文献报道,内质网Ca2+-ATP酶的激动剂毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)通过排空胞内钙库诱导钙释放激活的钙通道(CRAC通道)开放引起胞外Ca2+内流。在胞外液内含有2mM Ca2+时,1μM TG诱导产生较大Ca2+瞬变,虎杖苷明显降低Ca2+瞬变幅度,ΔF／FO从对照组的1.44±0.08(n=36)减少到虎杖苷治疗组的0.67±0.03(n=65,p<0.01 vs对照组)。为了区分胞外Ca2+通过CRAC通道内流在虎杖苷介导的Ca2+瞬变中所起的作用,我们首先在无细胞外Ca2+时用TG刺激,此时产生的Ca2+瞬变完全由细胞内钙释放引起。然后细胞外液换成2mMCa2+的液体,诱导一个完全由胞外Ca2+通过CRAC通道的内流的Ca2+瞬变。虎杖苷能够明显降低第二个Ca2+瞬变的幅度,ΔF／FO从对照组的1.58±0.14(n=127)减少到虎杖苷处理组的0.49±0.07(n=51,p<0.01 vs对照组)。这些数据进一步证实,虎杖苷通过抑制细胞外钙通过CRAC通道内流而减少免疫性刺激物诱导的肥大细胞产生的Ca2+瞬变。4.虎杖苷减少免疫性刺激物活化的RBL-2H3细胞胞内氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)的产生。已有文献报道,免疫性刺激物诱导的肥大细胞脱颗粒与ROS生成的增加有关,ROS刺激肥大细胞的CRAC通道开放,产生Ca2+瞬变,从而引起肥大细胞脱颗粒。我们采用DCFH-DA标记细胞内ROS,发现DNP-BSA增加胞内ROS的生成,而虎杖苷能够明显减少ROS的生成。对照组DNP-BSA引起ROS生成增加76%±3.0%(n=127),而虎杖苷组DNP-BSA引起ROS生成增加仅为50%±4.1%(n=137,p<0.01 vs阳性对照组)。这些数据表明：虎杖苷可能通过降低活化肥大细胞的氧化应激来抑制CRAC通道的活性。二.虎杖苷抑制OVA诱导的Balb/c小鼠过敏性哮喘4-6周龄的Balb/c mice小鼠,随即分成4组,即对照组,单独虎杖苷组,过敏性哮喘模型组,虎杖苷过敏性哮喘治疗组。过敏性哮喘通过OVA诱发。1.虎杖苷降低过敏性哮喘Balb/c小鼠气道对乙酰甲胆碱的反应性采用测量Balb/c小鼠气道高反应性的装置,给Balb／c小鼠雾化吸入乙酰甲胆碱,浓度依次为1mg/mL、10mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、100mg/mL),观察Balb/c小鼠对不同浓度乙酰甲胆碱的反应性,在过敏性哮喘组,不同浓度乙酰甲胆碱相对应的基线增加百分比值依次为11.4%(n=6),58.3%(n=6),246.9%(n=6),492.0%(n=6),832.5%(n=6),而经虎杖苷治疗后,基线增加百分比值依次降低到9.2%(n=6,p>0.05 vs过敏性哮喘对照组),24.1%(n=6,p<0.05 vs过敏性哮喘对照组),70.1%(n=6,p<0.01 vs过敏性哮喘对照组),211.4%(n=6,p p<0.01vs过敏性哮喘对照组),和351.8%(n=6,p p<0.01 vs过敏性哮喘对照组)。这些结果提示：虎杖苷可能通过降低气道对乙酰甲胆碱的反应性来改善Balb／c小鼠过敏性哮喘症状。2.虎杖苷明显降低支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒细胞数目用冰冷磷酸盐缓冲液(PBS)500μL进行支气管肺泡灌洗(BALF),反复抽吸3次,然后回收支气管肺泡灌洗液(BALF),并记录回吸收量；BALF经500 g,37℃,离心5 min后,取离心后的沉淀细胞,用1mL PBS重悬细胞,进行计数；另取细胞悬液于洁净光滑载玻片上涂片,用刘氏染色液染色,计数200个细胞,进行细胞分类计数。发现过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液内的嗜酸性粒细胞明显增加,过敏性哮喘组嗜酸性粒细胞为69.2±3.1(n=6),虎杖苷治疗组嗜酸性粒细胞的数目显著减少至11.0±0.7(n=6,p p<0.01 vs过敏性哮喘对照组),结果表明：虎杖苷具有降低免疫性刺激物引起肺组织中的嗜酸性粒细胞浸润的作用。3.虎杖苷减轻过敏性哮喘小鼠肺组织的炎症反应,改善支气管结构的完整性先进行支气管肺泡灌洗,接着取肺组织做石蜡组织切片,结果发现过敏性哮喘组小鼠肺间质内有大量炎性细胞浸润,肺细支气管上皮细胞不同程度增生及肺细支气管一定程度的破坏；而虎杖苷组的肺间质炎性细胞明显减少,肺细支气管结构的完整性也有明显的改善,并且上皮细胞增生明显降低。提示虎杖苷可能通过改善肺功能来治疗过敏性哮喘。4.虎杖苷抑制过敏性哮喘小鼠肥大细胞CRAC通道的开放腹腔分离的肥大细胞用5μM Fluo-4染料染色30min,然后加1μM毒胡萝卜素(Thapsigargin),通过Fluo-4的荧光来反映肥大细胞胞内的荧光强度变化。TG在无Ca2+情况诱导胞内较少的Ca2瞬变,然后当细胞外液变为2mM Ca2+液体时,胞内的Ca2+瞬变明显增加。后者的Ca2+瞬变增加反映的是胞外Ca2+通过CRAC通道的内流,与过敏性哮喘小鼠相比,经过虎杖苷治疗后的过敏性哮喘小鼠,肥大细胞胞内出现的第二次Ca2+瞬变明显降低,F／F0从4.3±0.1(n=106)降低到3.2±0.2(n=52,p p<0.01 vs过敏性哮喘对照组),这些数据从在体水平进一步证实：虎杖苷具有抑制胞外Ca2+经过活化肥大细胞CRAC通道内流的作用,从而减轻过敏性哮喘的发生。5.虎杖苷降低过敏性哮喘小鼠血清中的IgE水平,升高血清中的IgG2a水平OVA致敏Balb/c小鼠。过敏性哮喘对照组小鼠血清IgE水平为0.54±0.14(n=18),当接受虎杖苷治疗后,血清中的IgE水平明显减少至0.32±0.08(n=18,p<0.01 vs过敏性哮喘对照组)；另外,过敏性哮喘对照组小鼠血清IgG2a水平为0.79±0.17(n=18),在接受虎杖苷治疗后,血清中的IgG2a水平明显增加至1.15±0.36(n=18,p<0.01 vs过敏性哮喘对照组)。IgE抗体为致敏性抗体已得到公认,而IgG抗体被大多文献证实是一种保护性抗体,它可以竞争性抑制IgE与其受体结合,从而减少肥大细胞脱颗粒,进而减轻过敏性哮喘症状。这些数据表明：虎杖苷可能通过减少血清中的IgE水平,增加血清中的IgG2a水平来减轻过敏性哮喘症状。结论：1虎杖苷剂量依赖性抑制免疫性刺激物引起的RBL-2H3肥大细胞脱颗粒。2虎杖苷通过抑制胞外Ca2+经过CRAC通道内流减少免疫性刺激物诱导的Ca2+瞬变。3虎杖苷抑制活化RBL-2H3细胞胞内ROS的产生。4虎杖苷对OVA诱导的过敏性哮喘具有治疗作用,表现为气道反应性降低、肺泡组织炎症细胞的浸润减少、血清中IgE水平降低,而IgG2a水平升高。5虎杖苷对过敏性哮喘治疗的一个重要机制：减少免疫性刺激物引起的ROS产生,从而抑制CRAC通道激活造成的细胞外Ca2+内流,进而抑制肥大细胞脱颗粒。