宫颈癌的高发病率,已然成为影响女性健康的主要恶性肿瘤疾病之一,位居妇科恶性肿瘤之首。宫颈癌的致病因素多且复杂,主要有病毒感染、性行为不洁、多次分娩及其他有可能致病的生物学因素和行为因素等。宫颈癌最重要的致病因素是人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染。HPV病毒感染会导致人体内发生炎症反应,与此同时,宫颈癌的发生过程也被认为是一种慢性炎症产生的过程,因此炎性细胞将肿瘤的发生和炎症的产生联系到了一起。巨噬细胞是肿瘤组织中存在最多的炎性细胞。浸润在各种肿瘤病变组织中的所有巨噬细胞的统称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)。TAM可根据巨噬细胞激活的Th细胞类型不同分为M1型和M2型,其中M1型可促进肿瘤免疫、抑制肿瘤发生;M2型可以引发免疫耐受,刺激肿瘤细胞的增殖与转移能力。Tim-3是Tim家族成员中的一种,是T细胞免疫球蛋白域及黏蛋白域蛋白-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3)的简称,Tim-3表达水平与M1/M2巨噬细胞的极化以及在肿瘤病变发展过程中的作用值得进一步研究。有研究表明,M1巨噬细胞、M2巨噬细胞及Tim-3与多种肿瘤的预后有关,但具体TAM的极化及Tim-3在宫颈癌中的作用尚不明确。为阐明宫颈肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞TAM及Tim-3在宫颈癌发生发展中的作用,本课题将进行以下研究:(1)检测宫颈癌组织、癌旁组织标本中M1型、M2型TAM及Tim-3的表达水平,并检测其表达水平与宫颈癌分期、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移、生存时间及患者预后之间的相关性。(2)分析宫颈肿瘤微环境对巨噬细胞极化及Tim-3的作用。(3)分析Tim-3及TAM极化对宫颈癌的增殖、凋亡、侵袭、转移等细胞生物学行为的影响。通过以上研究,探讨肿瘤相关巨噬细胞极化及Tim-3在宫颈癌肿瘤微环境中的作用,探讨其临床意义,为宫颈癌的肿瘤免疫治疗提供新的思路和靶点。具体研究内容如下:一、TAM分型及Tim-3的表达水平与宫颈癌病理特征的相关性探索[研究目的]探索TAM分型及Tim-3表达水平与宫颈癌分期、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移、生存时间及患者预后之间的相关性。[研究方法]收集宫颈癌患者癌组织和癌旁组织标本,采用免疫组化法检测CD68阳性M1型TAM和CD163阳性M2型TAM及Tim-3的分布密度和表达水平。同时进行随访,结合临床及病理特征,分析M1型TAM、M2型TAM表达阳性率及Tim-3表达水平与宫颈癌病理特征之间的相关性。【研究结果】(1)未发生淋巴脉管间隙浸润患者的组织样本中M1/M2巨噬细胞的分布密度分别为6.9± 1.2/17.2± 1.5,Tim-3表达水平为0.009±0.001,发生淋巴脉管间隙浸润患者的组织标本中M1/M2巨噬细胞的分布密度分别为10.6士2.1/25.6±3.1,Tim-3表达水平为0.019±0.003,阳性患者样本中M1/M2巨噬细胞的表达水平显著增高,差异具有统计学意义(P=0.016/P=0.022<0.05),Tim-3的表达水平显著增高,差异具有统计学意义(P=0.018<0.05);未发生淋巴结转移患者的组织样本中M1/M2巨噬细胞的分布密度分别为6.6±0.8/9.6士 1.3,Tim-3表达水平为0.017±0.004,发生淋巴结转移患者的组织标本中M1/M2巨噬细胞的分布密度分别为9.8±2.1/15.8±1.9,Tim-3表达水平为0.025±0.003,阳性患者样本中M1/M2巨噬细胞的表达水平显著增高,差异具有统计学意义(P=0.021/P=0.036<0.05),Tim-3的表达水平显著增高,差异具有统计学意义(P=0.040<0.05);未发生宫旁浸润患者的组织样本中M1/M2巨噬细胞的分布密度分别为15.1 ±2.2/10.3±2.5,Tim-3表达水平为0.009±0.001,发生宫旁浸润患者的组织标本中M1/M2巨噬细胞的分布密度分别为21.8±1.3/21.8±1.7,Tim-3表达水平为0.013±0.002,阳性患者样本中M1/M2巨噬细胞的表达水平显著增高,差异具有统计学意义(P=0.019/P=0.019<0.05),Tim-3的表达水平显著增高,差异具有统计学意义(P=0.026<0.05)。(2)癌旁正常组织M1型、M2型TAM的分布密度平均分别为(3.9±2.6)个/HP和(2.3±1.6)个/HP;Ⅰ期到Ⅱa期宫颈癌肿瘤组织中M1及M2的分布密度平均为(18.6±2.2)个/HP和(5.2±1.1)个/HP;IIb期到IV期宫颈癌肿瘤组织中M1及M2的分布密度平均分别为(10.6±2.8)个/HP和(32.7±4.3)个/HP;Tim-3蛋白在癌旁组织,宫颈组织癌变的早期和晚期(Ⅰ-Ⅱa 期,Ⅱb-Ⅳ期)均有表达,灰度值分别为 0.011±0.001,0.089±0.003,0.298±0.007。宫颈癌患者的患者CD68+M1巨噬细胞、CD163+M2巨噬细胞以及Tim-3表达水平与生存期均成负相关,高密度组(高表达组)5年生存率明显低于低密度组(低表达组)。进一步多因素回归分析发现宫颈癌组织中M1/M2巨噬细胞及Tim-3表达水平的浸润密度或表达水平均是独立的预后因素。[结论]晚期宫颈癌中M1型TAM的表达水平低于早期宫颈癌M1型巨噬细胞密度,而M2型TAM的表达水平明显升高,说明了 M1型、M2型TAM的失衡可能是宫颈癌发生发展的重要因素,通过检测M1、M2型TAM的阳性率可以有利于判断宫颈癌的分期,进而有利于判断患者的预后。此外,晚期宫颈癌中Tim-3的表达水平明显高于早期宫颈癌患者,说明Tim-3表达水平也是判断宫颈癌发生发展的一个重要指标,检测Tim-3的表达水平有利于判断宫颈癌分期及预后,为宫颈癌的肿瘤免疫治疗提供新的思路和靶点。二、宫颈癌肿瘤组织微环境调控TAM极化及Tim-3表达水平的研究[研究目的]研究宫颈癌肿瘤组织微环境调控TAM极化及Tim-3表达水平,有望在未来为诊断和治疗宫颈癌提供新方法和新思路。[研究方法]在体外将宫颈癌组织细胞和髓源性单核细胞共孵育,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和RT-PCR测定TAM分泌的促炎性细胞因子IL-6、iNOS、MCP-1、IL-10和Arg-1的分泌水平。[研究结果](1)早期宫颈癌组织细胞与髓源性单核细胞共孵育后较单纯髓源性巨噬细胞,M1型TAM相关因子IL-6、MCP-1、iNOS表达水平均明显增加,有统计学意义(P值均小于0.05),而M2型TAM的相关分泌因子IL-10和Arg-1等表达水平无明显增加,无统计学意义(P值均大于0.05);晚期宫颈癌组织细胞与髓源性巨噬细胞共孵育后较早期宫颈癌组织细胞与髓源性单核细胞共孵育,M2型TAM相关分泌因子IL-10和Arg-1等表达水平均显著增加,有统计学意义(P值均小于0.05),而M1型TAM相关因子IL-6、iNOS、MCP-1表达水平无明显增加,无统计学意义(P值均大于0.05)。(2)早期宫颈癌组织细胞与髓源性巨噬细胞共孵育后,Tim-3的表达水平无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05),晚期宫颈癌组织细胞与髓源性巨噬细胞共孵育后,Tim-3的表达水平增加明显,差异具有统计学意义(P＜0.001)。[结论]本实验通过不同分期的宫颈癌组织细胞与髓缘性单核巨噬细胞共孵育的方法,考察了宫颈癌微环境对巨噬细胞极化的影响。早期宫颈癌细胞可将髓源性巨噬细胞向M1型巨噬细胞诱导分化,晚期宫颈癌细胞可将随缘性巨噬细胞向M2型巨噬细胞诱导分化。分化后M2型巨噬细胞中Tim-3的表达水平明显高于M1型巨噬细胞。三、TAM极化及Tim-3表达水平对宫颈癌组织细胞的增殖与迁移能力的影响【研究目的】揭示TAM极化及Tim-3表达水平对宫颈癌细胞增殖与迁移能力的影响。【研究方法】设计Tim-3的siRNA序列,转染HeLa细胞,Western blotting检测siRNA转染效果;MTT法检测转染后细胞增殖情况;Western blotting法检测siRNA转染后E-cadherin及N-cadherin表达水平的变化;Transwell实验检测细胞的体外迁移能力。【研究结果】Tim-3沉默抑制了宫颈癌细胞的迁移,宫颈癌组织中存在的Tim-3蛋白能够促进宫颈癌细胞的迁移。Tim-3基因经siRNA沉默后,能够明显促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin的表达;进而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖和迁移。【结论】Tim-3大量存在时可以促进宫颈癌组织的增殖,Tim-3表达被沉默之后,宫颈癌组织细胞的增殖率降低。Tim-3能够促进肿瘤细胞增殖且可以促进肿瘤组织细胞的迁移能力。Tim-3的表达对宫颈癌组织细胞的侵袭能力起到增强作用。