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花生,作为一种重要的植物油料蛋白资源,含有人体必需的八种氨基酸、是适合人类食用的非常理想的优质食用蛋白源。本文以花生分离蛋白为研究对象,通过酶法制备花生肽,考察不同酶解产物的抗凝血活性;在筛选获得合适蛋白酶的基础上,对其酶解产物进行分离纯化,并通过液质联用分析高抗凝花生肽的一级结构。通过酶种筛选,确定使用Alcalase 2.4L酶解花生蛋白;通过响应面设计试验优化得到其最佳酶解工艺条件:底物浓度50.mg/mL,加酶量为5000U/(g蛋白),反应温度55℃,pH 9,酶解时间2h。花生蛋白的水解度为19.1%,得到酶解物60mg/ml时候凝血酶抑制率可达到86.62%。使用制备RP-HPLC分离花生蛋白酶解物,通过单因素试验确定其最佳分离条件:乙腈浓度25%、进样浓度20mg/mL、进样体积1mL,流速5mL/min。在此优化条件下得到3个主要花生肽组分(G1,G2和G3),其中G2组分抗凝血活性最好,浓度为40mg/mL时,对凝血酶的抑制率达到94.2%。进一步采用半制备RP-HPLC分离G2组分,获得其最佳洗脱条件为:乙腈/水=15/85(v:v),进样浓度7mg/mL,进样体积80μl,流速1.5mL/min。在此分离条件下得到5个主要肽组分,其中G2-R3的抗凝血效果最好,在0.41mg/mL时,可以完全抑制凝血酶的活性即100.07;G2-R5的抗凝血效果次之,在0.40mg/mL的时抗凝血活性为100.00%。采用液质联用分别分析组分G2-R3和G2-R5的结构,发现两者均不是单一组分,在G2-R3鉴定出2个活性肽结构,分别是Gly-Asn-His-Glu-Ala-Gly-Glu(分子量:712.19)和Cys-Phe-Asn-Glu-Tyr-Glu(分子量:803.23);在G2-R5中鉴定出2个活性肽结构,分别是Pro-Ala-Ser-Gln-Gly-Glu(分子量:587.24)和Asn-Ala-Gly-Leu-Asn-Asp-Pro-Met-Asp-His-Glu(分子量:1211.47)。