目的:外阴硬化性苔癣是一种皮肤病变,属于女性外阴上皮内非瘤样病变的范畴,它可以于任何年龄的女性发生,尤其中老年女性最常见。主要发生于外阴及肛周皮肤,其表现主要皮肤组织发生色素脱失,白变,与外阴鳞状上皮增生外观难以区分,临床症状相同,两种皮肤病变难以区分,需要病理检查进行区别,常被统称为外阴营养不良性疾病。外阴硬化性苔癣的表皮细胞层变薄,硬缩,真皮胶原纤维变性呈现玻璃样变,均匀一致的匀质带形成为主要病理标志。主要症状为顽固性的外阴瘙痒,并且在入睡时瘙痒特别明显,治疗的主要目的是抑制瘙痒,但效果不理想,容易反复发作。病变长时间持续下去会导致很多的并发症,常见的有大小阴唇缩小融合、外阴阴蒂处形成挛缩瘢痕、阴道口粘连阴道外口逐渐狭窄等解剖形态的改变,患者伴随会有性情绪的异常。还有4%的患者会发生恶性变,恶变成外阴上皮癌,即外阴鳞状细胞癌。人们经常还会发现,在外阴鳞癌的癌旁会有脱色的皮肤组织,在脱色的组织其中超出60%的患者会查找到外阴硬化性苔癣的病变情况出现,因而,学者把外阴硬化性苔癣认定为是外阴鳞状细胞癌的癌前病变。外阴硬化性苔癣的病因目前仍不清楚,根据文献的报道,发病机制可能与免疫平衡失调、激素、遗传、细胞周期调控失调、特殊病原体感染、氧化应激、局部病变等相关因素有关,其中自身免疫失调在所有发病因素中都占有重要地位,受到国内外学者的广泛重点关注。分子生物学检测技术的不断发展,目前很多与外阴硬化性苔癣致病相关的基因片段和蛋白已经被发现,但该病变确切的发病机制仍未探清。蛋白质组学是一项相对较新颖的实验技术,是指以某个特定组织单位的所有蛋白质组为研究对象,从整体的角度,来分析组织细胞内某一时点不断变化的全部蛋白质构成与活动规则情况。通过对有可比性的正常组织及病变组织间的所有蛋白质组比较分析,进而筛选出与疾病有特异关系的单个蛋白质分子,那么与传统的单个蛋白质研究相比,蛋白质组学是使用高通量的研究方式,一下筛选出多个蛋白质,利用此方法在研究某种病理生理发生机制的基本问题方面达到了最大的规模,与传统的方法对比,节省了挑选的时间,又降低了各种蛋白相互干扰的情况,有利于对整体相关蛋白的筛选和蛋白质之间相互关系的确立。蛋白质组学虽然开始使用的时间不是很长,但用在探究针对细胞的增殖、凋亡、异常分化、肿瘤相关领域,逐渐变成了及其有效的探索工具。本研究使用蛋白质组学方法,即双向荧光凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence differencs gel electrophoresis,or 2D-DIGE)结合激光基质辅助解吸电离飞行质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization of Flight Mass Spectrometry,or MALDI-TOF-MS)鉴定的方式,对外阴硬化性苔癣组织(VLS)和外阴正常皮肤组织(VNS),先把差异性表达的蛋白质筛选出来,然后针对有意义并相关的蛋白质使用常用的实验方式,既Western-bloting及免疫组织化学sp法的方法对部分筛选出的差异表达蛋白质进行扩大样本的验证和表皮或真皮的组织学定位,进一步对这些差异蛋白的可比较性鉴定,以期待从整体角度探讨外阴硬化性苔癣的发病机制。利用原代细胞培养技术、免疫细胞化学鉴定、细胞增殖曲线检测及荧光染料法Rt-PCR技术检测半乳糖凝集素-7(Galectin-7)对外阴正常皮肤成纤维细胞增殖情况及合成胶原能力的作用及影响,以期初步探讨真皮病变的相关机制。实验方法:1、组织总蛋白的提取、定量及纯化:收集外阴硬化性苔癣标本组织及外阴正常皮肤组织各6例分别进行总蛋白质的提取。根据2D Clean-up Kit蛋白质纯化试剂盒使用说明书开展总蛋白质的提纯。依据蛋白质定量试剂盒(2D Quant Kit)使用说明书展开总蛋白质浓度的测定。2、双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)及图像分析:用荧光标识已经提取出来的总蛋白,随后开始第一向固相pH梯度等电聚焦,然后用胶条来平衡,继而开始SDS聚丙烯酰胺第二向凝胶电泳。把电泳后的胶板扫描并分析。3、MALDI-TOF-MS蛋白鉴定及生物信息学分析:制做凝胶样本及点样,然后将样品放入质谱仪中开始荧光波普鉴别,链接EMBL-EBI数据库进行查询,并对挑出的蛋白质开展生物讯息的分析。4、使用免疫组化SP法对10例外阴正常皮肤组织和15例外阴硬化性苔癣中的皮肤桥蛋白(Dermatopontin or DPT),膜粘连蛋白A2(Annexin A2 or AnexA2),半乳糖凝集素-7(Galectin-7)及过氧化物还原酶4(Prx4 or Peroxiredoxin 4)的表达情况进行半定量分析以及定位分析(表皮真皮)。5、使用Western-blot蛋白印迹法对10例外阴正常皮肤组织和15例外阴硬化性苔癣中DPT,Prx4,AnnexinA2及Galectin-7的表达情况进一步半定量检测及鉴定。6、使用组织块贴片接种法将正常外阴皮肤组织中的成纤维细胞开展原代提取培养、分离并用免疫细胞化学对原代的成纤维细胞开展波形蛋白的染色鉴定。7、应用MTS法检测不同浓度Galectin-7对外阴正常皮肤成纤维细胞增殖的影响。8、使用荧光定量逆转录Rt-PCR方法检测不同浓度Galectin-7培养下,原代外阴正常皮肤成纤维细胞中合成的Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的情况。实验结果:1、有114个双向荧光差异凝胶电泳中差异明显的蛋白质点被切取,其中得到了鉴定结果的有107个。剔除重复的蛋白质,最终有92个差异蛋白质被获得。其中,在外阴硬化性苔癣组织中表达上调的蛋白质为40个,表达下调的蛋白质为52个。2、查询EMBL-EBI数据库分别获取92个差异蛋白的生物学信息,既最主要的生物功能及细胞组织定位。差异蛋白质的生物学功能表现多样,其中主要包括凋亡(25.01%),信号转导(3.26%),代谢酶(24.59%),转运(9.78%),细胞骨架(32.61%),细胞粘附(4.35%)。对92个差异蛋白的亚细胞定位进行分析,其中72个位于细胞质(78.26%),10个位于细胞核(10.87%),5个位于细胞膜(5.43%),还有5个为细胞外分泌蛋白(5.43%)。3、免疫组织化学检查结果提示Annexin A2,Prx4,Galectin-7,DPT表达阳性的细胞主要位于正常外阴皮肤组织的表皮细胞全层,阳性颗粒分布在细胞浆和细胞核,其中DPT蛋白在真皮层细胞和间质中也有表达。这4种蛋白阳性表达细胞在外阴硬化性苔癣组织中也主要存在于表皮细胞层,而真皮层细胞中基本未见阳性表达。进一步半定量分析提示外阴硬化性苔藓与外阴正常表皮中4种蛋白的表达之间差异均有显著性(P<0.05)。免疫组化结果与前面蛋白质组学的结果相同,在外阴硬化性苔癣组织中,Galectin-7过表达,有显著性差异(P<0.05),DPT,Prx4及Annexin A2低表达,有显著性差异(P<0.05)。4、Western-blot的结果提示,与正常皮肤组织相比,在外阴硬化性苔癣组织中Annexin A2,Prx4及DPT的表达下降,有显著性差异(P<0.05);Galectin-7呈过表达,有显著性差异(P<0.05)。这一结果与免疫组织化学相同,进一步验证了蛋白质组的结论。5、MTS检测结果显示Galectin-7在体外既可促进也可抑制外阴正常成纤维细胞的增殖,该作用受培养基中Galectin-7浓度影响,超过0.5μg/ml Galectin-7培养基可导致细胞增殖受限,甚至抑制。6、PCR的结果显示在Galectin-7作用下,外阴成纤维细胞合成Ⅰ型/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA均增加,与Galectin-7浓度呈正相关。随着Galectin-7浓度的增加,Ⅰ型/Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的比例逐渐下降,与Galectin-7浓度呈负相关。结论:1、运用蛋白质组学技术共筛选出92种差异蛋白,其中40种蛋白质在外阴硬化性苔癣组织中表达上调,52种蛋白质在外阴硬化性苔癣组织中表达下调。2、通过验证实验发现Galectin-7在外阴硬化性苔癣组织中显著高表达,Prx4,Annexin A2及DPT在外阴硬化性苔癣组织中显著低表达,可能参与表皮萎缩及真皮匀质化的行成。其表达情况和前面的蛋白质组结果相同。3、Galectin-7有促进和抑制外阴皮肤成纤维细胞增殖的作用。浓度小于0.5μg/ml Galectin-7的培养基中,细胞增殖受到促进。浓度大于0.5μg/ml Galectin-7的培养基中,细胞增殖受到抑制。4、Galectin-7可以促进外阴皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白,改变Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白的分布比例。随Galectin-7浓度增高,胶原蛋白合成增多,而Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白比例呈下降趋势。