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microRNAs(miRNAs) 是一类广泛存在于动植物中的非蛋白编码的小分子RNA,通过与靶基因转录本的特异性结合,引起靶基因mRNA的降解或蛋白的翻译抑制,从而在生物体中行使重要的调控功能。越来越多的研究表明,miRNAs参与到包括发育、分化、生长和代谢等在内的众多生命活动中,尤其是对于动物发育的调节,涉及了已报道的多个系统与器官,如神经、肌肉、生殖细胞和造血等系统的发育。
造血系统的发育为理解真核基因表达调控提供了重要的研究模型。过去几十年的研究发现,参与造血细胞生长和分化的相关基因的表达,不仅受到转录因子和染色质状态的影响,还在转录后水平受到miRNA的负性调控。为进一步深入研究造血相关miRNAs在血细胞发育中的生理功能和分子机制,目前有效的手段是通过生物信息学预测,通过体内外实验筛选和鉴定相应miRNA的靶基因。尽管大量的基因经过生物信息学的预测和体外luciferase报告系统(RA-In Vitro)的验证,被确定为miRNA的靶基因,但其中只有很少的一部分通过实验手段验证了miRNA与mRNA之间的生理性相互作用。我们的工作以进化中高度保守并在红系造血中特异表达的一个miRNA基因簇,miR-144和miR-451为研究对象,以研究造血发育的理想模式动物-斑马鱼为载体,力图阐明miR-144/451基因簇在原始红系造血过程中的生物学功能和作用机制。实验结果显示,miR-144和miR-451均在斑马鱼胚胎红系发育的特定阶段表达。通过使用体内一过性报告系统(TRA-In Vivo),我们从miR-144和miR-451的大量候选靶基因中成功筛选出它们各自的潜在靶基因:krüppel样锌指转录因子klfd和羟甲基胆素合成酶hmbsb。虽然klfd,miR-144,hmbsb和miR-451均表达于斑马鱼原始造血的红系祖细胞内,但体内生理性转基因报告系统(PRA-In Vivo)的进一步验证发现,只在klfd和miR-144之间存在功能性的相互作用,而hmbsb并不是miR-451生理背景下真正的靶基因。在miR-451靶基因验证未果而给我们带来失望之余,更向我们提出了一个重要的科学问题,如何正确有效地验证某一miRNA真正的生理性靶基因。我们的结果不仅反映了斑马鱼原始红系造血发育过程中miRNA-mRNA相互作用的复杂性,更进一步提出,包括生理性转基因报告系统和Western blot在内的多种方法的结合,可以作为验证miRNA生理性靶基因的重要实验策略和手段。
与此同时,针对miR-144作用机制的进一步研究发现,miR-144选择性调控胚胎期α-globin基因,而非β-globin的表达,这一调控依赖于转录因子klfd对α-globin基因启动子区域CACCC box的结合。目前,越来越多的参与调控β-globin基因表达的转录因子逐渐被发现,并在多个系统中得到验证,但α-globin基因的调控机制却了解甚少。我们的研究发现了选择性调控珠蛋白的miR-144-klfd信号通路,不仅加深了对基因调控层次和调控机制的理解,更为临床地中海贫血的治疗提供了新的理论依据。