土壤是一个庞大且极其复杂的生态系统,1克的土壤环境中,大约有105种微生物。不同的微生物基因组含有不同的天然产物合成基因簇,蕴含着丰富的微生物基因资源。微生物是许多生物活性天然产物(抗癌抗肿瘤药物、抗生素、生物酶)的主要来源之一。但是,根据现有的实验室条件以及传统的微生物分离培养方法,大约只有不到1%的微生物能够被培养出来,很大程度上限制了环境微生物资源的发掘与利用。为了最大程度上从环境微生物中获取新的基因信息和天然活性产物,可以先把环境中的全部微生物基因作为研究对象,然后再转入到可培养的微生物中进行异源表达,这种技术方法被称作宏基因组技术。这种方法可以极大程度上增加环境微生物基因资源的利用和获得新型活性天然产物的可能。迄今为止,有4700余种含卤天然产物被发现,并开发了多种抗生素包括免疫调节剂、抗肿瘤药物和酶抑制剂等活性物质。天然产物的卤化过程通常由卤化酶催化,卤素取代基深刻影响天然活性产物的多样性,卤元素的添加对化合物的生物活性产生较大的影响,所以筛选含有卤化酶基因的单克隆对发掘新的卤化物极为重要。本课题组以云南土壤为样品来源,构建了云南土壤宏基因组文库。实验中先对云南土壤宏基因组文库中的菌液利用卤化酶兼并引物和PCR扩增的方法筛选含有卤化酶基因的阳性克隆,得到单克隆后进行测序,测序得到的序列在NCBI上与已知的卤化酶序列进行比对,最后对单克隆进行异源表达。在此次实验中共得到31个含有卤化酶基因的阳性单克隆。在所有的单克隆中1076编号用兼并引物筛得的片段大小为800bp左右,后设计特异引物再次筛1076混合菌液,测序结果与用兼并引物筛得的序列相似性为95%,可以认为是同一序列。单克隆测序得到的结果在NCBI上进行比对,比对结果显示筛得的单克隆中含有FADH2型卤化酶基因、色氨酸卤化酶基因。其中 2032-6、2165-1、2264-7、2270、2280-9、2295-5、2401、2435-1、2439-7、2472-4这10个单克隆编号的测序比对结果与已知的卤化酶基因的相似度较高,在85%以上。根据单克隆序列在MEGA上建立Neighbour Joining进化树,对进化树的分支进行分析得出:筛得的大部分单克隆序列与已知的化合物分支距离较远。但是,其中的编号2024-7与clorobiocin同属于一个分支,而且根据编号2024-7的末端测序结果得知,编号2024-7与5-oxoprolinase相似且与5-oxoprolinase底物具有相同的结构,编号 2032-6 所在分支包含了 已知的 balhimycin、ansamitocin、vancomycin、teicoplaincin、glycopeptide antibiotic这四种已知化合物,而且在NCBI序列比对结果中编号2032-6与已知化合物的卤化酶基因序列相似度高达95%。对筛得的单克隆进行转化,转化后进行异源表达。发酵液初提物经高效色谱检测,没有发现特异峰。对没有发酵得到特异峰的单克隆编号分析,分析结果可能是单克隆中不含有完整的卤化酶基因簇,还有一方面可能是转入的表达宿主不合适。