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研究目的:探索慢病毒载体介导下STAT1基因在肝癌MHCC97L细胞中过表达和STAT1基因沉默后在MHCC97L细胞中表达量的变化及其分子生物学机制,从而探明STAT1基因是否为影响肝癌细胞生物学效应的靶向基因。研究方法:①根据人类STAT1基因的mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建过表达载体,然后转化至感受态DH5α细胞进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装产生慢病毒,再将慢病毒载体转染至人肝癌MHCC97L细胞,荧光定量PCR及Westernblot检测MHCC97L原始细胞株、MHCC97L-statl稳转细胞株中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。②设计shRNA干扰序列3对及对照序列1对,构建3个shRNA干扰慢病毒载体,并转化至感受态细胞DH5α行测序验证。脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,侵染人肝癌MHCC97L细胞,荧光定量PCR及Western blot检测MHCC97L原始细胞株、MHCC97-statl过表达细胞株、MHCC97-shSTATl干扰细胞株中STAT1的表达情况,明确STAT1干扰的可行性。研究结果:STAT1基因过表达研究结果:①STAT1基因合成:通过人类基因组数据库STAT1mRNA序列,全基因合成STAT1基因(CDS区域序列)并基因测序验证成功;②过表达慢病毒颗粒的包装:脂质体介导下转染293T细胞成功,慢病毒侵染MHCC97L细胞,24h后荧光及可见光显微镜下观察细胞,可见大部分细胞发出荧光,侵染成功;③PCR法检测STAT1基因的表达:侵染48h后,相对于原始MHCC97L细胞,稳转细胞株MHCC97-statl的STAT1基因表达量提高了10938倍,差异具有统计学意义(P<0.01),说明过表达慢病毒STAT1基因对人肝癌MHCC97L细胞的侵染率大于90%;④Western blot法检测STAT1基因过表达:稳转细胞株MHCC97-statl的STAT1基因的蛋白条带较原始MHCC97L细胞明显增粗。STAT1基因干扰沉默研究结果:①干扰慢病毒载体的构建和鉴定:shRNA干扰序列3对,另有对照序列1对连接入pLKO-1-EGFP-puro并基因测序验证成功;②干扰慢病毒颗粒的包装:脂质体介导下转染293T细胞成功,慢病毒侵染MHCC97L-STAT1细胞,24h后荧光及可见光显微镜下观察细胞,可见大部分细胞发出荧光,侵染成功;③PCR法检测STAT1基因的表达:侵染48h后,相对于原始MHCC97L细胞,pLKO-1-statl-shRNA-1和pLKO-1-statl-shRNA-2的干扰效果比较好,各自的干扰效率为81.4%和72.1%,差异具有统计学意义(P<0.05),说明干扰慢病毒STAT1基因对人肝癌MHCC97L细胞干扰效果较好;④Western blot法检测STAT1基因沉默后的表达:稳转干扰细胞株MHCC97-shSTATl的STAT1基因的蛋白条带较原始MHCC97L细胞、过表达STAT1的稳转细胞明显减少。结论:慢病毒介导的STAT1基因过表达技术在肝癌MHCC97L细胞中构建成功并实现基因的过表达;干扰慢病毒基因沉默STAT1基因在MHCC97L细胞中构建成功并证实目的基因表达量的显著下调,为后续研究STAT1基因作为肝癌治疗的靶向基因及过表达和沉默后对参芪扶正注射液抑瘤作用变化的影响留作铺垫,为后续参芪扶正注射液体外研究提供可靠理论基础。