第一部分复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注骨骼肌损伤保护机制的研究第一章复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注氧化损伤的保护机制目的：探讨复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注骨骼肌氧化损伤的保护机制。方法：选用SD雄性大鼠56只，随机分为对照组（Control组）、缺血再灌注组（IR组）和复灌Ⅰ号药物干预组（Ⅰ-IR组）三大组。对照组8只（未造成缺血-再灌注损伤）；缺血-再灌注组24只，再分为再灌注后2h（IR-2）、4h（IR-4）和8h（IR-8）三小组，每小组8只；复灌Ⅰ号药物干预组24只，再分为再灌注后2h（Ⅰ-IR-2）、4h（Ⅰ-IR-4）和8h（Ⅰ-IR-8）三小组，每小组8只。对照组所有大鼠用橡皮筋松弛环绕双后肢不阻断血流；IR组和Ⅰ-IR组，按张连元所报道的方法复制SD大鼠后肢缺血-再灌注模型。对照组动物不给药物；IR组于造成缺血前12小时、造成缺血时和再灌注时于腹腔内各注射生理盐水1ml；Ⅰ-IR组于造成缺血前12h、缺血时和再灌注时腹腔各注射复灌Ⅰ号注射液1ml。各组动物于相应时间点切取约1000mg右侧腓肠肌中部肌肉，冰盐水中快速洗去血液，滤纸吸干水份，剪碎制成匀浆，用于骨骼肌MDA、SOD、MPO的检测，另切取部分腓肠肌，固定于福尔马林溶液中行组织切片检查，再切取左后肢腓肠肌行干湿重比值的检查，然后于下腔静脉穿刺取血，离心，行血清MDA、SOD、MPO、NO检测。结果：（1）MDA的检测结果：IR与Ⅰ-IR各组MDA含量均较对照组为高其差异有统计学意义（P＜0.01），且在8h内随着时间的延长而逐渐增高。而复灌Ⅰ号干预各组在相应时间点均较IR组为低，除骨骼肌Ⅰ-IR-4组与IR-4组相比其差异为P＜0.05外，其余各组间比较其P值均小于0.01。（2）SOD的检测结果：IR与Ⅰ-IR各组血清和骨骼肌SOD值均较对照组为低，其差异有统计学意义（P＜0.01），在8h内其含量随时间的延长而逐渐降低。除血清Ⅰ-IR-2组与IR-2组相比其差异为P＜0.05外，其余各时间点Ⅰ-IR组与IR组比较其P值均小于0.01。（3）MPO的检测结果：IR与Ⅰ-IR各组血清和骨骼肌MPO值均较对照组为高，其差异有统计学意义（P＜0.01），在8h内随时间的延长其含量逐渐升高，而Ⅰ-IR各组在相应时间点上均较IR组为低，其差异均有统计学意义（P＜0.01）。（4）骨骼肌干湿重的检测结果：IR与Ⅰ-IR各组骨骼肌水肿明显，8h内水肿逐渐增加，与对照组相比其差异有统计学意义（P＜0.01），而Ⅰ-IR各组在相应时间点上水肿程度均较IR组为轻，除Ⅰ-IR-2组与IR-2组相比其差异为P＜0.05外，其余各相应时间点Ⅰ-IR组与IR组间比较其P值均小于0.01。（5）血清NO的检测结果：在再灌注后2h时为最高，8h内随着时间的延长而逐渐下降，IR与Ⅰ-IR各组NO含量均较对照组为高，其差异有统计学意义（P＜0.01），而Ⅰ-IR各组较IR组为低，其差异有统计学意义（P＜0.01）。（6）组织切片的检测结果：缺血-再灌注组各时间点肌肉组织水肿、肌纤维断裂并有大量炎症细胞浸润，而复灌Ⅰ号注射液可明显减少炎症细胞的浸润，在肌肉细胞的水肿和肌纤维的损伤方面也有一定的减轻。小结：1．复灌Ⅰ号注射液可减少氧自由基的产生。2．复灌Ⅰ号注射液可减轻SOD降低的程度，更有利于机体清除氧自由基。3．复灌Ⅰ号注射液可降低PMN的游出数量，同时减少其在组织中的聚集，降低了炎症反应。4．复灌Ⅰ号注射液可降低血清中NO的含量。5．复灌Ⅰ号注射液可减轻组织水肿程度。第二章复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌细胞凋亡的影响研究目的：探讨复灌Ⅰ号注射液对大鼠肢体缺血-再灌注骨骼肌细胞凋亡的影响。方法：将第一部分所取的部分骨骼肌标本进行固定、脱水、包埋后切片，采用SABC法进行免疫组化染色，经Motic Image advanced 3.1图像分析系统测定Bax、Bcl-2蛋白灰度值，然后对Bax、Bcl-2免疫组化阳性反应产物进行定量分析。结果：骨骼肌组织经Bax、Bcl-2免疫组化染色后，高倍镜下胞浆染色为棕黄色为阳性表达，标记强度用灰度值表达，阳性表达愈强，灰度值愈低。应用图像分析系统（Motic Image advanced 3.1北京航天航空大学产品）测定Bax、Bcl-2蛋白灰度值。（1）Bax免疫组化结果示：对照组骨骼肌组织中未见有阳性细胞表达，Bax灰度值为188.50±13.43，在再灌注损伤8h内，IR组与Ⅰ-IR组各时间点灰度值随时间的延长而逐渐下降，说明Bax表达随再灌注时间延长而增强，除IR-2组和Ⅰ-IR-2组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组与对照组比，其差异均有统计学意义（P＜0.01）；但Ⅰ-IR各组在相应时间点上其灰度值均较IR组为高，除2h时其差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各时间点其差异均有统计学意义（P＜0.05）；（2）Bcl-2免疫组化结果示：对照组未见阳性细胞表达，Bcl-2灰度值为183.75±8.28，再灌注损伤8h内，2h时表达最为明显，其后随时间的延长其表达逐渐减弱，灰度值逐渐升高，与对照组相比，其差异有统计学意义（P＜0.01）。与IR组相比，Ⅰ-IR组各时间点的阳性表达均稍高，除2h外，其他各时间点差异均有统计学意义（P＜0.01）；（3）Bcl-2／Bax结果示：再灌注8h内，随时间的延长，其比值逐渐增加，说明其细胞凋亡越来越重，但Ⅰ-IR各组在相同时间点上较IR各组为低，除2h时间点外，其他时间点其差异均有统计学意义（P＜0.05），说明复灌Ⅰ号注射液在缺血-再灌注损伤中有抗骨骼肌细胞凋亡的作用。小结：复灌Ⅰ号注射液可以降低Bax的表达，升高Bcl-2的表达，从而减少骨骼肌细胞凋亡，对肢体缺血-再灌注损伤的骨骼肌起到一定的保护作用。第二部分大鼠肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌钙调蛋白表达的变化及复灌Ⅰ号注射液对其影响的研究目的：探讨大鼠肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌钙调蛋白表达的变化以及复灌Ⅰ号注射液对变化的影响。方法：54只SD大鼠随机分为3大组，分别为对照组（control组）、缺血-再灌注组（IR组）和复灌Ⅰ号药物干预组（Ⅰ-IR组）。对照组6只；缺血-再灌注组24只，再分为再灌注后0h（IR-0组）、2h（IR-2组）、4h（IR-4组）和8h（IR-8组）四小组，每小组6只；复灌Ⅰ号药物干预组24只，再分为再灌注后0h（Ⅰ-IR-0组）、2h（Ⅰ-IR-2组）、4h（Ⅰ-IR-4组）和8h（Ⅰ-IR-8组）四小组，每小组6只。对照组所有大鼠用橡皮筋松弛环绕右后肢不阻断血流；IR组和Ⅰ-IR组，按张连元所报道的方法复制SD大鼠右后肢缺血-再灌注模型。对照组动物处死前不给药物，缺血-再灌注组于造成缺血前12小时、造成缺血时和再灌注时于腹腔内各注射生理盐水1ml；复灌Ⅰ号药物干预组于造成缺血前12h、缺血时和再灌注时腹腔各注射复灌1号注射液1ml。各组动物于相应时间点在右后肢相应区域内剪毛，络合碘消毒，于右后肢后内侧沿肢体长轴方向切开皮肤，游离皮肤及皮下组织，剪除深筋膜，切取约1000mg腓肠肌，冰盐水快速洗去血液，滤纸吸干水份，剪碎制成组织匀浆，用于RyR₁和SERCA₁的RT-PCR检测。结果：（1）骨骼肌型RyR₁mRNA的RT-PCR结果：在肢体缺血-再灌注损伤再灌注8h内，IR组骨骼肌型RyR₁mRNA在再灌注0h、2h表达上调，与对照组相比，其差异有显著性意义（P＜0.01），4h时有所恢复，但8h时表达下调，与对照组相比，其差异有统计学意义（P＜0.01）。复灌Ⅰ号注射液干预组0h稍有增强，增强幅度较IR组为小，与对照组和IR组相比其差异均无统计学意义（P＞0.05），缺血2h时其表达也最强，但要比IR为弱，两组差异有统计学意义（P＜0.01），4h时与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），8h也表现为降低，但降幅要比IR组为小，其差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）SERCA₁mRNA的RT-PCR结果：对于SERCA₁mRNA的表达，再灌注8h内随时间的延长其表达逐渐下降，与对照组相比，其差异均有统计学意义（P＜0.01）。复灌Ⅰ号注射液干预各组的表达也随时间延长而下降，但下降幅度较IR组为小，可减缓其下降速度，与IR组相比，除2h时外，在0h（P＜0.05）、4h（P＜0.01）、8h（P＜0.01）等时间点其差异均有统计学意义。小结：1．在再灌注8h内，肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌中RyR₁mRNA早期表达上调，后期表达下降，SERCA₁mRNA表达随时间的延长而逐渐下降。这可能是肢体缺血-再灌注骨骼肌损伤的重要原因之一。2．复灌Ⅰ号对缺血-再灌注损伤中骨骼肌的保护作用可能是通过双向调节RyR₁以使早期减轻胞浆钙超载，后期保护细胞器的作用来实现的。这可能是其防治肢体缺血-再灌注损伤，减轻骨骼肌损伤的主要分子机制之一。