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第一部分自噬相关蛋白Beclinl和LC3在人钙化性主动脉瓣膜中的表达目的：探讨自噬相关蛋白Beclinl和LC3在高血脂钙化性主动脉瓣膜疾病(CAVD)患者瓣膜中的表达及意义。方法：入选高龄(>55岁)高血脂(血清总胆固醇>5.7mmol/L>甘油三酯>1.70mmol/L) CAVD患者20例,在瓣膜置换术中摘取病变主动脉瓣叶组织作为实验组；入选年龄小于40岁血脂含量正常的心脏移植患者10例,B超诊断及肉眼观察主动脉瓣结构与功能正常,取其作为正常对照组。通过HE、Masson及α-SMA免疫荧光染色观察瓣膜形态结构,Von Kossa染色检测瓣膜钙盐沉积情况,采用免疫组化染色检测钙化相关蛋白(骨钙素)和自噬标志蛋白(Beclinl, LC3)在瓣膜组织中的分布及表达。结果：(1)高龄高脂CAVD患者主动脉瓣膜在HE、Masson及α-SMA免疫荧光染色中显示,瓣叶明显增厚,肌纤维和胶原纤维大量增生,瓣膜间质细胞表型向肌成纤维细胞转变,正常对照组瓣膜染色显示结构层次清楚,厚度正常(P<0.05)；(2)在高龄高血脂CAVD患者主动脉瓣中,Von Kossa染色显示瓣膜中有钙盐沉积,正常对照组瓣膜无明显钙盐沉积(P<0.01)。(3)免疫组化染色显示,钙化相关蛋白(骨钙素)在高龄高血脂CAVD患者主动脉瓣中呈阳性表达,对照组为阴性表达(P<0.05)；(4)免疫组化结果同时显示：自噬标志蛋白Beclin1、LC3表达含量在高龄高血脂CAVD患者主动脉瓣膜中明显高于对照组(P<0.05)。结论：高龄高血脂CAVD患者病变主动脉瓣中,在瓣膜发生钙化性病变的同时,自噬相关蛋白Beclinl和LC3表达增加,从而提示自噬可能参与CAVD病理生理。第二部分自噬相关蛋白Beclinl和LC3在CAVD小鼠动物模型主动脉瓣膜中的表达目的：探讨自噬相关蛋白Beclinl和LC3在CAVD小鼠动物模型主动脉瓣膜中的表达及意义。方法：选择C57BL/6J背景apoE-/-6-8周龄的雄性小鼠,在心脏彩超和血生化指标(血糖血脂)检查正常后,随机分为两组：正常对照组(n=10),给予正常饮食饲养；实验组：给予Western diet饲养(n=20)。在SPF级条件下连续饲养6月后,做以下检测：(1)心脏B超检测主动脉瓣口直径；(2)抽血检测血脂水平；(3)取出主动脉瓣膜组织固定、包埋、切片后进行HE染色和Von Kossa染色,检测瓣膜形态和钙盐沉积情况；免疫组化染色,检测钙化相关蛋白(骨钙素),Wnt信号通路中Wnt3a、β-catenin蛋白和自噬标志蛋白(Beclinl, LC3)在瓣膜组织中的表达和分布。结果：(1)心脏B超检测实验组较对照组主动脉瓣口直径明显减小(P<0.05)；(2)实验组血脂水平显著高于对照组(P<0.01),血糖水平差异无明显统计学意义。(3)HE染色显示实验组瓣叶相对正常对照组明显增厚;Von Kossa染色显示实验组为阳性,对照组为阴性(P<0.01)；免疫组化检测显示：实验组组织钙化相关蛋白(骨钙素)、Wnt信号通路中Wnt3a、β-Catenin和自噬标志蛋白(Beclinl, LC3)的表达为阳性,对照组为阴性(P<0.05)。结论：高脂饮食能诱导小鼠主动脉瓣膜钙化,钙化瓣膜中自噬相关蛋白Beclinl和LC3表达明显增加,从而提示自噬可能参与调控瓣膜钙化进程,促进CAVD的发生。第三部分：调控Beclin1表达对ox-LDL诱导huVTC过度自噬及钙化的作用目的：通过上调和下调Beclinl基因表达,观察人瓣膜间质细胞(huVICs)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激后自噬性死亡和钙化相关分子的表达。方法：(1)获取心脏移植病人正常瓣膜样本,分离得到原代huVICs并鉴定。(2)通过Dil-ox-LDL摄取试验,观察huVICs摄入ox-LDL的情况；用不同浓度ox-LDL (25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)干预huVICs,活性氧检测试剂盒检测活性氧水平；添加植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(lectin-like ox-LDL receptor-1, LOX-1)抗体阻断,通过Dil-ox-LDL摄取试验和Western Blot法检测huVICs中LOX1蛋白水平。(3)筛选可诱导huVICs过度自噬的ox-LDL浓度,并以此浓度干预,通过透射电镜和mRFP-GFP-LC3双荧光指示技术观察过度自噬现象,免疫印迹技术检测自噬标志蛋白、自噬性死亡、凋亡及钙化相关蛋白水平。(4)转染携带Beclinl过表达和沉默腺病毒,RealTime-PCR和Western Blot法检测转染效率,构建ox-LDL体外诱导huVICs自噬-钙化模型,免疫印迹技术检测自噬标志蛋白、自噬性死亡、凋亡及Wnt信号通路蛋白和钙化指示蛋白水平。结果：(1)免疫荧光染色显示,huVICs标志蛋白α-SMA和Vimentin均为阳性表达。(2)荧光显微镜观察证实huVICs能摄取ox-LDL入胞；加入LOX-1抗体阻断,结果发现LOX-1抗体明显降低ox-LDL的摄取率,而且LOX1蛋白表达随ox-LDL浓度的增高而增强；用不同浓度ox-LDL干预huVICs48h后,流式细胞仪检测发现,ROS水平随着ox-LDL浓度的增高而升高(P<0.01)。(3)100μg/mL浓度ox-LDL干预huVICs48h,透射电镜观察细胞内大量自噬空泡堆积,mRFP-GFP-LC3双荧光指示技术观察到指示自噬体形成的荧光斑点大量出现；免疫印迹技术检测显示：自噬标志蛋白Beclinl和LC3、自噬性死亡调控蛋白hMOF、Acetyl-Histone H4(Lys16)、促凋亡因子Caspase-3和Bax、Wnt3a和β-Catenin等蛋白表达量升高,抑制凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达量降低(P<0.01)。(4) Beclinl过表达时,Beclinl和LC3、hMOF、 Lys16、Caspase-3和Bax、钙化相关蛋白OCN、Wnt3a和β-Catenin等蛋白表达量均升高,Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达量降低；Beclin1适度沉默时,Beclin1和LC3、hMOF、 Caspase-3和Bax、OCN、Wnt3a和β-Catenin等蛋白表达量均下降,Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达量增加(P<0.01)。结论：高浓度ox-LDL刺激大量ROS产生,可诱导huVICs过度自噬,继而增加自噬性死亡和Wnt信号通路激活。通过对Beclin1靶点干预,调控huVICs自噬程度,减轻瓣膜钙化进程。