笃斯越桔(Vaccinium uliginosum Linn.)是长白山苔原带的优势植被之一,因其生长在海拔2000—2500m的高山环境条件下,生长季节短,一年内大部分时间生长在寒冷或积雪环境条件下。根据达尔文的“适者生存”的进化机制,笃斯越桔在长白山高山苔原带的逆境条件下一定拥有其内在抗逆适应机制。作为植物体内无所不在的共生物,内生真菌在笃斯越桔的适应进化过程中一定起着非常重要的作用。因受长白山自然保护区严格生物多样性保护管理措施的限制,长白山苔原带笃斯越桔内生真菌还未见有系统的研究报道。作为长白山森林生态系统的重要组成部分,植物内生真菌的功能还未得到深入阐述。另外,随着越来越多的植物内生真菌的药用代谢产物资源的发现,对特殊生境下的笃斯越桔内生真菌的研究则更有现实研究意义。因此,本文于2018和2019年的生长季节对长白山苔原笃斯越桔进行了植株样品采集,并利用组织学分离鉴定技术和高通量测序技术相结合的方法,对不同时期、不同海拔的长白山苔原带笃斯越桔不同组织部位的内生真菌多样性进行了调查分析。此外,笃斯越桔中可分离出大量有效活性成分。鉴于内生真菌通过发酵等方式可产与寄主植物相同或相似的代谢产物,因此,本文又利用高通量测序技术对笃斯越桔内生真菌产具有较高药用价值的黄酮类等化合物的特性进行了分析,并对分离得到的笃斯越桔内生真菌产黄酮类化合物能力进行了检测,具体研究结果如下:1.从不同时期、不同海拔采集的150份长白山苔原带笃斯越桔样品的不同部位中,共分离到775株内生真菌,通过形态学和分子生物学鉴定,这些内生真菌分属于4门、21目、31科、48属。通过比较不同时期、不同部位、不同海拔采集分离得到的笃斯越桔内生真菌的数量和种类,发现其内生真菌的数量和种类上均呈现一定的分布规律。其中,笃斯越桔内生真菌在不同时期的分布规律是8月份内生真菌的数量和种类最多,9月份次之,7月份最少。不同部位的分布规律是从笃斯越桔茎部分离得到的内生真菌的数量高于叶片,且内生真菌在茎中的定殖率和分离率均比叶片中的高。不同海拔梯度的分布规律是随海拔的上升,分离到的笃斯越桔内生真菌数量和种类均呈下降趋势。2.通过分离频率(RF)对所分离到的笃斯越桔内生真菌的优势菌进行分析。结果显示,笃斯越桔中分离到的的优势菌属为链格孢属(Alternaria)和镰孢菌属(Fusarium),这两种菌属的分离频率分别为16.90%、14.06%。3.通过Shannon-Wiener多样性指数、Margalef丰富度指数和Sorenson相似性系数对不同海拔梯度的笃斯越桔内生真菌的物种多样性和相似性进行分析。Shannon-Wiener多样性指数结果显示,随着海拔的升高,笃斯越桔内生真菌的多样性指数逐渐下降,海拔在2000-2100m下,笃斯越桔内生真菌的多样性指数最高。Margalef丰富度指数结果与Shannon-Wiener具有相同的规律,即在2000-2100m海拔下,笃斯越桔内生真菌的丰富度指数最高。Sorenson相似性系数结果显示,不同海拔笃斯越桔的内生真菌具有一定的相似性,且海拔高度接近的,其内生真菌的相似度较高。4.通过Illumina高通量测序技术,共获得10G的数据量,经过滤后共获得45,298,621条reads,Q20值为97.84%,GC含量为40.64%,表明测序质量良好,可用于后续对长白山苔原带笃斯越桔内生真菌的物种多样性分析和功能注释。5.根据高通量测序的结果,通过Nr数据库对长白山苔原带笃斯越桔内生真菌多样性进行分析,结果显示,从笃斯越桔中共检测到的内生真菌分属于8门、40纲、96目、225科、416属、790种。其内生真菌群主要由嗜根菌属(Rhizophagus)、Hyaloscypha、瓶头霉属(Phialocephala)、蝾螈壶菌(Batrachochytrium)、柄锈菌属(Puccinia)、暗膜菌属(Amorphotheca)、瓶霉属(Phialophora)、Baudoinia、曲霉属(Aspergillus)、假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)等组成。6.通过KEGG数据库和CAZy数据库对长白山苔原带笃斯越桔的内生真菌产黄酮类等代谢产物的特性进行注释分析。经KEGG数据库对比结果显示,与黄酮类化合物合成相关的代谢通路有1条,与萜类化合物合成相关的代谢通路有3条。经CAZy数据库对比结果显示,在GTs家族中的GT1中注释到了与黄酮类化合物合成直接相关的基因。7.对笃斯越桔内生真菌产黄酮类化合物进行检测。结果显示,所检测的内生真菌均可产黄酮类化合物,其中,Fusarium菌株经发酵后产黄酮类化合物的量最高,其发酵菌丝体中黄酮类化合物的含量为6.13mg/g,而Alternaria菌株产黄酮类化合物的量最低,为2.23mg/g。