麻竹2个同源异型盒基因(KNOX)的分子特征及功能研究

来源 :中国林业科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong507
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竹子是重要的森林资源,因其具有成林快、生物量大等独特的优势,所以对竹资源的开发利用日益增加。同源异型盒基因家族(homeobox gene family)编码的蛋白作为转录因子,在生物体形态建成、模式形成和细胞命运的决定中起着重要的作用。为揭示竹子快速生长的调节机制,本研究以重要的笋材两用竹种--麻竹(Dendrocalamus latiflorus)为材料,分离节部发育调控相关的同源异型盒基因,并对其进行功能研究,以期从分子水平上揭示同源异型盒基因在竹子节部形态建成中的作用,为通过基因工程来实现对竹子生长发育的调控,培育新品种提供理论基础。主要研究结果如下:第一,基因的克隆及其生物信息学分析。利用RT-PCR和RACE方法,扩增得到2个麻竹同源异型盒基因的全长cDNA序列,分别命名为DlKNOX1和DlKNOX2。DlKNOX1基因的cDNA全长1514bp,编码358个氨基酸;DlKNOX2基因的cDNA全长1452bp,编码330个氨基酸。蛋白结构分析表明,这2个基因所编码的氨基酸包含4个结构域:KNOX1区、KNOX2区、ELK区、HOMEOBOX区,属于KNOX蛋白。应用MEGA4软件的系统进化树分析表明:DlKNOX1和DlKNOX2与单子叶植物的KNOX蛋白聚类到一起,说明与其亲缘关系较近。第二,基因的组织特异性表达。利用Real-time PCR技术分析麻竹KNOX基因在不同组织中的表达模式。结果表明:DlKNOX1和DlKNOX2在麻竹的根、幼茎、叶片、叶鞘、节中均有表达,且在节中的表达量最高。但是这2个基因在不同组织中的表达量存在着一定的差异,其中DlKNOX1在节、茎和鞘中表达量分别是根中表达量的136.8倍、21.4倍和7.6倍;DlKNOX2在节、茎和鞘中表达量分别是根中表达量的36.6倍、14.5倍和14.2倍。第三,基因的异位表达。构建植物过量表达载体pPZP-DlKNOX1和pPZP-DlKNOX2,转化拟南芥,通过卡那霉素抗性筛选获得转基因植株。观察表型可知,转基因植株在表型上出现了一系列明显不同于野生型的变化,包括:(1)叶型变化,表现为叶片皱缩、叶片螺旋、缺刻叶片、小型叶等;(2)株型变化,表现为植株生长延缓、植株矮化,顶端优势丧失、茎顶端分生组织缺失等现象;(3)花型与开花时间变化,表现为花冠表面皱缩,花冠呈不规则形状,开花时间明显延迟;(4)果荚变化,转基因植株有的一个节长出2个果荚、有的同侧生长、有的对称生长等现象。第四,基因的原核表达。将编码麻竹KNOX成熟蛋白的基因序列克隆入载体pMAL-c5X中,获得含有目的基因的原核表达载体pMAL-c5X-DlKNOX1和pMAL-c5X-DlKNOX2。分别将表达载体质粒转化表达菌株(E.coli ER2523)后,进行体外诱导表达。通过优化表达条件,分别在28℃和37℃(0.3mM IPTG诱导2h)条件下获得DlKNOX1和DlKNOX2表达丰度较高的可溶性蛋白,大小分别为82kD(包含了MBP42.5kD和DlKNOX1成熟蛋白39.5kD)、79.4kD(包含了MBP42.5kD和DlKNOX2成熟蛋白36.9kD),与预期相符。通过MBP标签亲和层析的方法进行蛋白纯化,使用anti-MBP的单克隆抗体作为一抗进行Western blotting分析,在预测位置发生阳性反应,进一步证明获得了表达目的蛋白。基因工程是现代育种的重要手段之一,在林木定向育种中有着广阔的应用前景。本研究获得的麻竹同源异型盒基因KNOX编码的蛋白是重要的转录因子,基因的表达表明KNOX基因对竹子节部的发育具有调控作用,这对于揭示竹子快速生长发育的分子机制以及今后新品种培育具有重要意义。
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