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MHCⅠ四聚体(major histocompatibility complexⅠtetramer)可以对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)进行检测和筛选,是了解机体细胞免疫功能、探索疾病机理和评价特异性免疫疗法的重要工具之一。由于具有敏感、特异、高效、对细胞无损伤等优点,MHCⅠtetramer技术一诞生就成为CTLs定量检测的金标准。但是传统MHCⅠ四聚体制备流程繁琐,蛋白复性时需要MHCⅠ及β2-microglobulin(β2m)两条肽链及抗原肽同时正确折叠,复性效率很低,对抗原肽的亲和力要求也高,亲和力低的抗原肽很难形成稳定的四聚体。由于存在上述不足,限制了MHCⅠtetramer技术的大规模应用,许多学者都试图对该技术进行改进。单链三聚体(single chain trimer, SCT)是将抗原肽、β2m和MHCⅠ分子以适当的接头(linker)依次串联而成,是对传统四聚体技术的重大改进,更有利于抗原特异性CTLs的检测。慢性髓细胞样白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增生性疾病。PR1为来自CML相关抗原蛋白酶3的HLA-A*0201限制性9肽(VLQELNVTV),其诱导的CTLs可杀伤白血病细胞,但对正常骨髓细胞无毒性。本研究的目的是制备HLA-A*0201限制性的PR1-HLA-A*0201-SCT(以下简称PR1-SCT)四聚体,以联合流式细胞技术对PR1特异性CTLs进行研究,为CML的过继细胞免疫治疗奠定基础。本研究中,我们首先利用基因工程技术将PR1肽、β2m及HLA-A*0201以(G4S)n柔性linker依次串联,构建PR1-SCT融合基因,再克隆至pQE31载体中进行原核表达,通过洗涤包涵体获得大量PR1-SCT包涵体蛋白。接着我们利用pQE31载体中的6×His tag对PR1-SCT包涵体蛋白进行纯化,通过稀释复性使其恢复天然构象。通过在复性体系中引入2 mol/L尿素,大大提高了复性效率。我们进一步对复性的PR1-SCT蛋白进行生物素化,并根据生物素化效率,与PE标记的链霉亲和素按适当比率混合,制成新型PR1-SCT四聚体,并对其进行了初步鉴定,期望能为CML的临床和基础研究提供有力工具。