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背景:在临床医学、法医学等领域,对弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury,DAI）的诊疗与鉴定都是核心工作及研究热点。对于DAI发生后存活时间较短的案例,更需要能够及早发现病因、客观表征病变、准确剖析病理。本研究旨在探寻利用傅里叶变换红外光谱逐点扫描面成像技术（Fourier transform infrared spectroscopy mapping,FTIR-mapping）检测DAI的特异性光谱指标,从化学键的红外光谱角度探讨DAI的病理改变,并尝试建立一种更为直观、准确、灵敏的DAI法医病理学检测方法。在当前的实际工作中,尤其在法医学鉴定上,研究人员对DAI的认定主要通过观察大体标本、组织切片,对损伤病变从宏观到微观进行综合判断。由于DAI的病理改变在形态学上呈现得往往较为复杂,这对全面认识病变,准确判断损伤部位与程度提出了较高的技术要求。一方面是制作组织切片与组织染色要求高。要观察DAI后轴索的形态学改变,或检测DAI引起的一些生物学标志物的表达改变,主要利用免疫组织化学染色、银染等在亚细胞水平进行的检测方法。这些方法的高准确度一定程度上依赖检材的科学取样、切片的标准制作及染色过程的精细操作,这需要经验丰富的技术人员来完成。另一方面是镜下图像分析水平要求高。在显微镜下分析切片的染色情况,判断染色阳性强度,是一种较为主观的组织病理学查验过程。若经验不足就常常难以准确地辨识和认定轻度改变或微小病变。另外,传统方法在用于诊断DAI时自身存在不足之处。譬如,各种生物标志物经免疫组织化学染色后,可能显示出轴索断裂,但不能表明系原发性还是继发性,而且倘若轴索尚未出现明显形态改变,标志物则不能呈阳性表达表现,无法发挥出诊断价值。每次免疫组织化学染色只能对单一某项生物学标志物进行分析,不能同时联用标志物体系加以诊断。银染法对急性期DAI的轴索损伤也不能及时反映。因此,本研究计划通过动物实验,利用FTIR-mapping技术,打破依赖轴索形态诊断DAI的局限性,探索一种能快速、准确地从分子层面检测DAI的方法,服务法医病理学司法鉴定工作。神经细胞具有细胞膜、细胞质、细胞核等结构,其化学组分的物理性质在不同部位展现出不同特点。许多疾病、损伤的发生发展,会引起组织成分发生不同变化,并可以表现出红外光谱的差异。红外光谱与其它分子光谱类似,能辅助确定分子组成、空间结构。FTIR是将干涉图经傅里叶转换所形成的红外光谱,既可以用于定性分析,又可以用于定量分析,还可以对未知物质进行解读。红外吸收峰的位置、形状及强度,都透露了未知分子的功能基团构成,甚至组成的化学结构。FTIR技术在样品制备、检测操作、数据分析、经济效益等方面都具有显著优势,检测限低、适用范围广,在化工、医药、珠宝鉴定、法庭科学等诸多领域都有所应用。利用FTIR技术检测DAI分子变化,目前报道极少,而利用面成像（mapping）技术对DAI的分子特征进行测定,目前只有杨天潼博士报道过蛋白酰胺Ⅱ带的检测成果。用FTIR-mapping技术探索DAI的分子特征,不仅可以了解分子振动模式、基本基团组成,还可以绘制2D、3D化学图像,通过红、黄、绿等色彩差异表现蛋白质、核酸等分子基团的含量与分布,与特殊染色的病理组织切片相对应。本研究属于化学技术与法医病理学、神经科学的交叉性创新研究。目的:建立大鼠DAI模型,观察大鼠伤后神经行为反应,研究DAI大鼠脑组织β-APP特殊染色、GFAP特殊染色的特征;研究大鼠脑损伤后DAI病变发生发展过程,通过FTIR显微镜检测DAI大鼠脑白质化学物质成分,寻找特异性红外光谱指标;研讨mapping图像与组织病理之间的对应关系,提炼有价值的数据结果,为将来应用FTIR-mapping技术在分子层面上鉴定DAI打下基础。方法:实验材料及仪器SD大鼠;落体打击装置;傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet TM 7500-Ⅱ）及显微镜附件;红外光谱工作站（OMNIC 6.0）;虚拟显微成像系统（Dotslide 2.1）;脱水机、包埋机、切片机、展片机、烤片机等;苏木素、伊红、天然树胶、二甲苯、乙醇、氨水、硝酸银等。研究方法及实验手段实验第一部分:建立轴索损伤模型。选取雌雄不限的SD大鼠共24只,按随机抽样原则分为2组,每组12只,建立Marmarou打击负荷损伤模型,落体打击后24h处死大鼠取脑。对照组只采取手术,不进行打击,直接处死取脑。实验第二部分:对各组别脑组织进行红外光谱、生物学标志物检测,并进行数据分析。（1）对样本脑组织切片进行FTIR红外光谱逐点扫描,绘制mapping图像:（2）将连续切片的脑片进行β-APP染色,从组织病理学上确认轴索损伤区域,提取损伤区域内光谱信息,进行定量、定性数据分析,筛选出DAI特异性红外光谱参数。结果:经FTIR-mapping检测,实验组的蛋白质仲胺N-H伸缩振动、胶原蛋白三螺旋结构的高吸收区与β-APP验证的DAI区相符合,与低吸收区域相比,高吸收区吸收度差异性极其显著（P<0.05）,二者光谱高低吸收区的吸收度比率分别较对照组明显增高;蛋白质中CH3对称收缩、核酸和磷酸脂质PO2对称伸缩振动的吸收度与验证组差异性不显著（P>0.05）。FTIR-mapping的逐点扫描面成像技术绘制的化学图像基本可以反映DAI各大分子分布特征,并且与β-APP验证的弥漫性轴索损伤区基本一致。结论:傅里叶变换红外（FTIR）显微光谱是从组织切片中获取化学信息的强大技术。红外光谱化学图像以色彩差的方式揭示基团分布情况,并与组织病理相对应一致。应用FTIR-mapping技术能直观表现DAI的分子特征,分析分子指标的变化,从分子振动模式、振动频率推测DAI的发展过程,从病理形态学角度诊断DAI病变的部位,并根据红外吸收度值的改变情况判断脑组织DAI的损伤程度。蛋白质仲胺N-H伸缩振动、胶原蛋白三螺旋结构可以作为诊断DAI的特征性红外指标。经过进一步深入研究,有望应用FTIR-mapping技术进行DAI病理学诊断。