含有高浓度的硝酸盐废水来源广泛、成分复杂,如化肥制造、钢铁生产、火药制造、饲料生产、肉类加工、电子元件及核燃料生产废水等,物理化学方法用于处理较低浓度硝酸盐污染的废水时,会产生含高浓度的硝酸盐浓缩液,这些废水中既含有高浓度的硝酸盐,又含有大量的盐份(Cl-、Na-等)和部分有毒物质(苯酚、氯苯、重金属铬、镉等),会对微生物的生长产生抑制作用,从而增加生物处理的难度,成为现阶段国内外高硝态氮废水处理技术领域亟待解决的一个难题。为了解决这类含高硝态氮废水有效处理问题,本文以模拟含高硝态氮废水为基质,采用膨胀颗粒污泥床(EGSB)反应器生物处理系统,优化EGSB反应器的运行参数,并在不同胁迫条件下对其反硝化效果进行详细的分析,同时利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术、16S rRNA基因克隆与测序、高通量测序技术以及实时荧光定量PCR等分子生物技术对EGSB反应器反硝化体系的群落结构和功能基因进行解析,阐明宏观功能变化与微观结构之间的内在联系,为EGSB反应器有效处理含高硝态氮废水提供一定的理论依据和技术支持。主要研究结论如下所述：1)成功启动了EGSB反应器；并优化EGSB反应器反硝化最优运行条件为：HRT为24h,C/N摩尔比为2.0,pH值为6.2-8.2,Vup为3.0m/h。在最优运行条件下,进一步开展不同胁迫条件如负荷、NaCl盐、温度、苯酚、重金属铬与镉对EGSB反应器反硝化效果的影响及其微生物群落结构与功能分析。2) EGSB反应器能够几乎完全去除进水中高达14000mg/L的硝态氮,且出水中亚硝态氮含量较少。但当改变最优运行条件即HRT由24h降至16h时,其出水中亚硝态氮明显增加,最高浓度达到2909mg/L。DGGE指纹图谱表明随着进水硝态氮浓度的变化,反应器中总细菌群落的演变和更替较明显。部分条带克隆测序与NCBI对比的结果表明：EGSB反应器中的菌属大多耐盐、耐碱、具有有机物降解能力和反硝化特性的细菌,且系统中y-Proteobacteria纲为优势菌454测序结果分析表明：在硝态氮浓度最高时其微生物多样性明显低于接种污泥中的微生物多样性,但还是比较丰富,在相似度为97%时其OTUs为448,香农指数为4.83；此时主要菌门为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(A ctinobacterid)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi),其中变形菌门为主要菌门占总有效序列的83.72%,其次为厚壁菌门占13.12%。对反硝化效果起主要作用的菌属为Sporolactobacillaceae incertae sedis、 Anaerobranca、 Alkalibacterium、 Marinimicrobium、Nitrincola、Halomonas。3)连续与批次实验表明：在最优运行条件下采用EGSB反应器可以有效处理含盐量高达11%(w/v)NaCl高硝态氮(6000mg N/L)废水；当进水NaCl含量小于等于5%时,其反硝化降解过程符合零级动力学反应,其相应线性相关系数R2都大于0.93。DGGE指纹图谱表明随着NaCl盐含量的变化其总细菌群落的演变和更替较明显；部分条带克隆测序与NCBI对比的结果表明：EGSB反应器中的菌属大多是耐盐、耐碱、具有反硝化特性的细菌,且系统中y-Proteobacteria纲种属占较大比重。454测序分析可知：随着NaCl含量的增加,EGSB反应器中污泥里的微生物群落的丰富度及多样性降低；其主要菌门包括：变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、软壁菌门(Tenericutes),其中变形菌门(Proteobacteria)是其主要的菌门,占到所有菌门的90%以上,其次是厚壁菌门(Firmicutes)。菌属Halomonas和菌属Marinobacter的丰度占总菌属的75%以上,在EGSB反应器降解硝态氮过程中起到主要作用。通过定量PCR分析发现：含有反硝化功能基因narG、nirK、nirS、nosZ微生物随NaCl盐含量增加受到抑制程度增加,且对含有前三种功能基因narG、nirK、nirS的微生物抑制作用更强烈,而含有基因nosZ的微生物能够适应NaCl盐环境,并且在高NaCl盐含量时可能有促进其生长的作用。4)连续与批次实验分析表明：EGSB反应器处理高硝态氮反硝化适宜温度为常温与中温,当低于10℃与高温52℃时,其出水中都有亚硝态累积。通过高通量测序分析得出：反应温度对EGSB反应器中的微生物群落结构组成和多样性产生了影响,在反应温度为中温35。C时其微生物的多样性最丰富,在高温52℃时其微生物多样性最低；共获得7个菌门84种菌属,其中优势菌门为：Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes,分别在每个样品中占89-96%、1.90-6.00%、2.20-3.30%之间；优势菌属为：Halomonas、Azoarcus和Marinobacter,分别在每个样品中占41.62-81.59%、2.61-29.13%、0.86-2.89%；对EGSB反应器处理高硝态氮反硝化效果起到主要作用。qPCR分析表明：含有反硝化功能基因nirK、nirS、narG和nosZ多样性在不同反应温度下具有不同的丰富程度；nosZ基因在四种基因中丰度最高,其对应微生物的多样性最丰富,nirK基因丰度相对最低,其多样性在中温35℃时最丰富。5)连续与批次实验发现：当进水苯酚浓度小于等于600mg/L即替代乙酸钠碳源比例为26.8%时,硝态氮几乎完全反硝化,且其降解动力学符合非线性方程,相关系数都大于0.97；当大于600mg/L时,开始对EGSB反硝化效果产生影响；且其降解拟合的非线性方程相关系数较低,仅为0.79。由氯苯批次实验可知外加氯苯浓度超过200mg/L时,硝态氮及COD的去除率明显降低,且有大量亚硝态累积。当进水六价铬浓度超过80mg/L时,其出水中亚硝态氮严重累积,TOC的去除率也明显下降,硝态氮的去除略有下降,而六价铬的去除效果非常好,都达到99%左右；进水镉浓度提对EGSB反应器反硝化效果影响不大,且镉的去除率达到80%以上。高通量测序分析表明：各样品中的微生物多样性丰富程度的顺序为：T35>B600>Cdl6；有毒物质对EGSB反应器的微生物都有抑制作用,而金属镉的抑制作用比苯酚强。在门水平分析共检测到7个菌门,其中变形菌门Proteobacteria占到总菌门比例的88.42-97.26%之间,厚壁菌门Firmicutes占2.00-5.30%之间,拟杆菌门Bacteroidetes占0.17-3.79%之间。苯酚对变形菌门的抑制作用强于金属镉对其抑制作用；苯酚与镉离子都对厚壁菌门有明显抑制作用。镉离子对拟杆菌门抑制作用非常明显,而苯酚略有促进其生长作用。栖热菌门适应含苯酚的硝酸盐废水,而不适应含镉离子的硝酸盐废水。三个样品丰度排名前五菌属组成相同,即为Halomonas、Azoarcus、Pseudomonas、Wandonia、 Marinobacter,只是这五种菌属在三个样品中的排序不同,相对于含苯酚硝酸盐废水,含镉离子的硝酸盐环境更适合菌属Halomonas生长,而菌属Azoarcus更适应生长在含苯酚高硝酸盐废水中。qPCR分析可知：苯酚与镉离子对含有反硝化功能基因nirK、nirS和nosZ微生物都有抑制作用,而苯酚对含有基因narG的微生物可能有促进其生长作用,这与样品B600中固氮弧菌属(Azoarcus)丰度增加呈现对应关系,推断固氮弧菌属(Azoarcus)含有基因narG。