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目的:通过构建TAB182低表达人肺癌细胞株,开展以下三项工作:(1)探究TAB182对DNA损伤应答蛋白的表达调控;(2)探究TAB182对肺癌细胞EGFR的作用及机制;(3)阐明TAB182通过EGFR信号通路调控肺癌细胞EMT及侵袭迁移。方法:(1)建立shRNA介导的TAB182稳定敲低肺癌细胞株:用慢病毒颗粒感染A549和H1299肺癌细胞后,先用荧光显微镜观察GFP信号以验证感染效率,然后验证TAB182 mRNA及蛋白敲降效果。其中,Control-shRNA为TAB182正常表达细胞(下称对照细胞),TAB182-shRNA#1和TAB182-shRNA#2为TAB182敲降细胞。(2)验证TAB182参与DNA双链断裂损伤修复:用4Gy 60Coγ射线单次照射A549-TAB182低表达细胞株(下文默认照射方式为60Coγ射线单次照射),在照后0 h、1 h、2 h和4 h检测DNA双链断裂标志物γ-H2AX水平变化;验证HUWE1-shRNA敲低表达的Hela细胞株的HUWE1敲降效率,并在10Gy照后24 h内观察γ-H2AX焦点数量变化。(3)探究TAB182对DNA损伤应答蛋白的表达影响:分析A549和H1299-TAB182低表达细胞株中ATM、DNA-PKcs、Ku86、Ku70、Ct IP、EGFR、p21和p16蛋白水平改变。(4)探究TAB182对肺癌细胞EGFR信号的影响:分析A549-TAB182低表达细胞株中EGFR mRNA及蛋白水平。(5)探究TAB182对肺癌细胞EMT标志蛋白的表达影响:检测A549-TAB182低表达细胞株中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、Snail蛋白水平变化。(6)验证EGFR过表质粒效果:将EGFR过表质粒转入普通A549细胞中24 h后,分析EGFR、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和α-SMA表达变化。(7)探究EGFR是否介导TAB182调节肺癌细胞EMT:将EGFR过表质粒转入A549-TAB182低表达细胞株后24 h,检测EGFR、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和MMP-2表达改变。(8)验证EGFR蛋白的放射响应性:在4Gy照射普通A549细胞后1d和4 d,分析EGFR表达改变。(9)探究放射应答蛋白EGFR的剂量依赖性:在0.5、1、2、4、6、8、10Gy照射普通A549细胞后第7 d,检测EGFR表达变化。(10)验证TAB182蛋白的放射响应性:在4Gy照射A549-TAB182低表达细胞株后第3 d,分析TAB182表达改变。(11)在照射条件下探究TAB182对肺癌细胞EGFR信号及EMT表型的影响:在4Gy照射A549-TAB182低表达细胞株后0 h、24 h、48 h和7 d,检测EGFR及EMT分子标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达变化。(12)探究TAB182是否影响放射致肺癌细胞侵袭活性增强:在4Gy照射A549-TAB182低表达细胞株后第7 d,通过Transwell侵袭实验评价细胞侵袭活性。(13)探究TAB182对肺癌细胞EGFR蛋白稳定性的影响:在10μg/m L放线菌酮(CHX)处理A549-TAB182低表达细胞株后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24h,通过Western Blotting分析EGFR蛋白水平下降速率;为了在照射条件下研究EGFR稳定性,先用CHX预处理A549-TAB182低表达细胞株,然后在4Gy照后不同时间点分析EGFR蛋白水平变化。(14)探究TAB182对各类肺癌细胞表型的影响:在A549-TAB182低表达细胞株中,通过CCK-8活力实验检测细胞增殖活性;通过克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;通过划痕实验检测细胞迁移能力;通过Transwell侵袭实验评价体外侵袭活性。(15)探究EGFR是否介导TAB182调节肺癌细胞侵袭迁移:将EGFR过表质粒转入TAB182敲降肺癌细胞后24 h,通过Transwell迁移/侵袭实验评价细胞侵袭及迁移活性。结果:(1)建立TAB182低表达人肺癌A549和H1299细胞株。(2)敲低TAB182延长肺癌细胞γ-H2AX照后存留时间,并且上调ATM、DNA-PKcs、p21和p16水平;在10Gy照后1 h、2 h和4 h,敲低HUWE1可明显提高Hela细胞γ-H2AX焦点数量。(3)敲低TAB182可降低肺癌细胞EGFR mRNA和蛋白水平,而不影响EGFR蛋白稳定性。(4)敲低TAB182可上调E-cadherin,同时降低N-cadherin和MMP-2水平。(5)过表EGFR降低肺癌细胞E-cadherin水平,同时上调N-cadherin、Vimentin和α-SMA。(6)过表EGFR诱导TAB182敲降肺癌细胞下调E-cadherin并降低N-cadherin和Vimentin,但不影响MMP-2水平。(7)4Gy照射诱导肺癌细胞上调EGFR蛋白表达。(8)2Gy~10Gy照射以非剂量依赖的方式刺激肺癌细胞上调EGFR蛋白。(9)4Gy照射诱导对照肺癌细胞TAB182表达升高,但不影响TAB182敲降细胞中TAB182蛋白水平。(10)敲低TAB182可以抑制4Gy照射诱导肺癌细胞EGFR表达上调,并且敲低TAB182可以在4Gy照后48 h内缓解放射致肺癌细胞EMT分子改变。(11)4Gy照射同时显著提高对照肺癌细胞和TAB182敲降肺癌细胞的侵袭活性。(12)4Gy照射可以提高对照肺癌细胞中EGFR稳定性,并且敲低TAB182明显降低照后EGFR稳定性。(13)敲低TAB182明显抑制肺癌细胞增殖活力、克隆形成能力及侵袭迁移活性。(14)过表EGFR可以挽救TAB182敲降肺癌细胞的侵袭迁移活性。结论:1.TAB182参与DNA双链断裂损伤修复,并负调DSB感受器激酶ATM和DNA-PKcs及检查点调节子p21和p16表达水平。2.TAB182上调肺癌细胞EGFR信号,并且促进细胞增殖及克隆形成。3.TAB182通过EGFR信号通路促进肺癌细胞EMT和侵袭迁移。4.TAB182参与电离辐射诱导肺癌细胞EGFR信号,其潜在机制可能是TAB182在辐照条件下增强EGFR蛋白稳定性。