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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种重要的杀虫细菌。Bt菌株及其杀虫基因在害虫的生物防治和抗虫转基因植物研究中发挥了极其重要的作用。Bt杀虫剂作为应用最广泛的生物农药已在田间应用多年,然而由于目前Bt杀虫剂品种单一、昆虫对Bt产生抗性等问题使Bt杀虫剂的应用受到限制,因此,发掘高效特异性Bt菌株和新的功能基因,扩大Bt的杀虫谱和应用范围仍是当前本领域的研究热点之一。本研究通过利用Cry蛋白保守区域的四个简并引物,对实验室分离保存的有特殊活性或晶体形态特殊的Bt菌株中的22株进行了cry基因的PCR检测,并对其中四株菌的PCR产物进行了测序。从具有杀蝗虫活性的LH-2菌株(蝗虫死体中分离)中克隆到一个新的Cry7毒素蛋白基因(Accession Number:FJ93811),该基因大小为3432bp,编码1144个氨基酸。通过NCBI Blast分析该基因编码的毒素氨基酸序列,结果显示与Cry7Ba1相似性最高,为62%;该毒素被国际苏云金芽孢杆菌毒素命名委员会命名为Cry7Da1。从具有杀蚊活性的Bt菌株Y-5中克隆到一个类似Cry20Aa的毒素基因(.AccessionNumber:GQ144333),通过NCBI Blast分析,该毒素的氨基酸序列与Cry20Aa的同源性为56%,但在domainN与domainM之间有一个32bp的插入序列。从丑thuringiensis serovar.pingluonsis(H60)的标准菌株NXP15-04菌株中克隆到长度为471bp的基因片段,推导的157个氨基酸与CrylIb同源性为94%。从B.thuringiensis serovar.guiyangiensis(H43)的标准菌株KK31-01菌株中克隆到与Cry7Bal相似性为68%的长度为2574bp的基因片段,该片段编码855个氨基酸,包含完整的domainM,domainC及C-末端。
鞘翅目昆虫对杨树的生长危害严重,苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry3A具有抗鞘翅目活性。本研究以南林895杨(NL-895,Populus×euramericana cv。“Nanlin895”)为转基因受体材料,农杆菌介导的改良叶盘法,将本实验室克隆的具有自主知识产权的Bt cry3Aa8基因转入南林895杨树中。对11株筛选到的卡那霉素抗性植株进行了目的基因的PCR检测,获得3株可能整合了cry3Aa8基因的转化苗,并申请了农业部“中间试验”转基因植物安全性评价。