背景与目的抑癌基因INK4a在多种肿瘤中阴性表达,但在几乎100%宫颈癌中过表达,究其发生原因,目前尚无定论。人乳头瘤病毒（human papilloma virus, HPV）感染是宫颈癌发生的必要条件,其中50%以上是HPV16型。HPV的E6和E7基因整合到宫颈上皮细胞并持续表达是引发宫颈癌的主要原因,同时也是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。宫颈癌INK4a过表达是否与HPV感染有关,目前尚无统一认识。本研究拟通过RNA干扰技术,以抑制HPV16E7表达,进而检测对SiHa和CaSki细胞INK4a基因表达的影响;同时,比较不同HPV感染状态的宫颈癌细胞CaSki（HPV16感染）,HeLa（HPV18感染）,C-33A（无HPV感染）中INK4a表达水平,综合分析宫颈癌INK4a过表达与HPV感染的相关关系,初步阐明INK4a基因在宫颈癌中异常表达的可能机制,为宫颈癌的预防和早期诊断提供理论和实验依据。方法1.应用免疫组织化学技术检测126例HPV感染及未感染宫颈癌（cervical cancer,CC）、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）及慢性宫颈炎中INK4a表达规律及其与HPV感染之间的相互关系2.利用RNA干扰技术,针对HPV16E7的siRNA干涉SiHa和CaSki细胞,使HPV16E7 mRNA沉默3.应用RT-PCR技术,检测HPV16E7 siRNA干扰前后SiHa和CaSki细胞HPV16E7及INK4a mRNA4.应用Western blot技术,检测HPV16E7 siRNA干扰前后SiHa和CaSki细胞HPV16E7及INK4a蛋白表达5.应用流式细胞仪,检测HPV16E7 siRNA干扰前后SiHa和CaSki细胞周期分布情况6.联合应用RT-PCR和Western blot技术,比较不同HPV感染状态的宫颈癌细胞CaSki（HPV16感染）,HeLa（HPV18感染）,C-33A（无HPV感染）中INK4a表达水平结果1. 126例宫颈病变组织中INK4a表达规律及其与HPV感染之间的关系如下:（1） 126例宫颈病变组织中,CC,CIN,慢性宫颈炎中p16^INK4a阳性表达率分别为100.00（50/50）、71.93（41/57）、42.11（8/19）,三者间差异有显著性意义（p<0.05）。（2） 89例hr-HPV（+）宫颈病变组织中,CC,CIN,慢性宫颈炎中p16^INK4a阳性表达率分别为100.00%（42/42）、76.32%（29/38）、44.44%（4/9）,三者间差异有显著性意义（p<0.05）。（3） 37例hr-HPV（-）宫颈病变组织中,CC,CIN,慢性宫颈炎中p16^INK4a阳性表达率分别为100.00%（8/8）、63.16%（12/19）、40.00%（4/10）,三者间差异有显著性意义（p<0.05）。（4） 57例CIN中,CIN1,CIN2,CIN3 p16^INK4a阳性表达率分别为36.84%（7/19）、81.82%（18/22）、100.00%（16/16）,且三者间差异有显著性意义（p<0.05）。（5） 38例hr-HPV（+）CIN中,CIN1,CIN2,CIN3 p16^INK4a阳性表达率分别为37.50%（3/8）、73.33%（11/15）、100.00%（15/15）,CIN3与CIN2和CIN1之间差异均有显著性意义（p<0.05）,但CIN2和CIN1之间差异无显著性意义（p>0.05）。（6） 107例CC和CIN组织中p16^INK4a表达和hr-HPV DNA检测同时阳性71例,占66.36%（71/107）;p16^INK4a阳性表达而hr-HPV（-）21例,占19.63%（21/107）;p16^INK4a阴性表达而hr-HPV（+）8例,占7.57%（8/107）;p16^INK4a表达或hr-HPV DNA检测单一阳性加上共阳性占93.46%（100/107）。Pearson相关分析CC和CIN中p16^INK4a表达与宫颈hr-HPV感染相互间无相关性（p>0.05）。（7） 47例CC和16例CIN3中p16^INK4a全部阳性表达,无论HPV感染状态如何;38例hr-HPV（+）CIN组织中p16^INK4a表达29例,占76.32%（29/38）;19例hr-HPV（-）CIN组织中p16^INK4a表达12例,占63.16%（12/19）,两者间差异没有显著性意义（p>0.05）;15例hr-HPV（+）CIN2组织中p16^INK4a表达11例,占73.33%（11/15）;7例hr-HPV（-）CIN2组织中p16^INK4a表达7例,占100.00%（7/7）,两者间差异没有显著性意义（p>0.05）;8例hr-HPV（+）CIN1组织中p16^INK4a表达3例,占37.50%（3/8）;11例hr-HPV（-）CIN1组织中p16^INK4a表达4例,占36.36%（4/11）;两者间差异没有显著性意义（p>0.05）;9例hr-HPV（+）慢性宫颈炎中p16^INK4a表达4例,占44.44%（4/9）;10例hr-HPV（-）慢性宫颈炎中p16^INK4a表达4例,占40.00%（4/10）;两者间差异没有显著性意义（p>0.05）。比较分析发现,p16^INK4a蛋白在hr-HPV（+）和hr-HPV（-）宫颈病变组织中阳性表达率差异无显著性意义（p>0.05）。2. siHPV16E7 001,siHPV16E7 002,siHPV16E7 003干扰CaSki细胞后,HPV16E7 mRNA的含量下降,其中siHPV16E7 001干扰后,HPV16E7 mRNA的含量下降最明显,约80%;不同浓度siHPV16E7 001干扰CaSki细胞后,60nM组干扰效率最强,与未干扰组比较差异有显著性意义（p<0.01）,且细胞毒性轻微。3.和SiHa-Nontransfection组（0.6033±0.0186）及SiHa-siNControl组（0.5500±0.0173）相比,在SiHa-siHPV16E7组（0.3067±0.0120）中,RT-PCR方法证明其HPV16E7 mRNA表达显著降低（p<0.01）,Western blot方法亦证明SiHa-siHPV16E7组的HPV16E7蛋白表达量显著低于SiHa-Nontransfection组和SiHa-siNControl组（p<0.01）。提示通过RNA干扰方法能有效地抑制SiHa细胞的HPV16E7表达。4.和CaSki-Nontransfection组（1.1733±0.0667）及CaSki-siNControl组（1.3933±0.1667）相比,在CaSki-siHPV16E7组（0.4033±0.0328）中,RT-PCR方法证明其HPV16E7 mRNA表达显著降低（p<0.01）,Western blot方法亦证明CaSki-siHPV16E7组的HPV16E7蛋白表达量显著低于CaSki-Nontransfection组和CaSki-siNControl组（p<0.01）。提示通过RNA干扰方法能有效地抑制CaSki细胞的HPV16E7表达。5.和SiHa-Nontransfection组（1.0033±0.0233）及SiHa-siNControl组（0.9267±0.0371）相比,在SiHa-siHPV16E7组（0.5833±0.0133）中,RT-PCR方法证明其INK4a mRNA表达显著降低（p<0.01）,Western blot方法亦证明SiHa-siHPV16E7组的INK4a蛋白表达量显著低于SiHa-Nontransfection组和SiHa-siNControl组（p<0.01）。提示通过siHPV16E7干扰能有效地抑制SiHa细胞的INK4a表达。6.和CaSki-Nontransfection组（0.7833±0.0088）及CaSki-siNControl组（0.8533±0.0353）相比,在CaSki-siHPV16E7组（0.4767±0.0145）中,RT-PCR方法证明其INK4a mRNA表达显著降低（p<0.01）,Western blot方法亦证明CaSki-siHPV16E7组的INK4a蛋白表达量显著低于CaSki-Nontransfection组和CaSki-siNControl组（p<0.01）。提示通过siHPV16E7干扰能有效地抑制CaSki细胞的INK4a表达。7.细胞周期分析结果表明:HPV16E7干扰SiHa细胞24h,48h,72h后,G0-G1期细胞百分数较SiHa-Nontransfection组依次增加了1.1%,0.7%,31.7%,进入S期的细胞百分数较SiHa-Nontransfection组依次减少了0.2%,2.5%,6.4%;HPV16E7干扰CaSki细胞24h,48h,72h后,G0-G1期细胞百分数较CaSki-Nontransfection组依次增加了8.7%,12.7%,15.6%,进入S期的细胞百分数较CaSki-Nontransfection组减少了1.3%,4.3%,14.9%。提示通过siHPV16E7干扰能将更多的细胞阻滞在G0-G1期。8. RT-PCR检测不同HPV感染状态的宫颈癌细胞CaSki（0.3967±0.0491） ,HeLa（0.5567±0.1037）,C-33A（0.5633±0.0722）中INK4a mRNA表达无明显差异（p>0.05）;Western blot方法亦证明CaSki（0.4152±0.0255） , HeLa（0.5094±0.0361） , C-33A （0.5895±0.0409）中INK4a蛋白表达无显著性差异（p>0.05）。提示不同HPV感染状态的宫颈癌细胞中INK4a表达规律趋于一致。结论1.无论是否合并HPV感染,宫颈癌及CIN3组织中INK4a基因都过表达。2. siHPV16E7可序列特异性下调宫颈癌SiHa,CaSki细胞HPV16E7基因水平,显著降低HPV16E7蛋白表达。3.通过RNA干扰抑制HPV16E7表达后,能显著抑制INK4a基因表达,同时将更多的细胞阻滞在G0-G1期。4.不同HPV感染状态的宫颈癌细胞中INK4a表达规律趋于一致。综上提示,在合并HPV感染的宫颈癌中INK4a基因过表达与HPV感染有关;未合并HPV感染的宫颈癌中INK4a基因同样过表达,应另有其他机制存在。检测INK4a基因表达,对于宫颈癌的早期诊断和筛查具有非常有价值的临床意义。