背景与目的：非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver，NAFL）是一种获得性代谢应激相关的肝损伤，已成为严重威胁人民健康的代谢性疾病之一。但NAFL的发病机制尚不完全明确，脂代谢异常导致肝内脂质（尤其是脂肪酸和甘油三酯）沉积被认为是其发生发展的基础。其中核受体对其靶基因的转录调控异常将会导致肝细胞脂代谢紊乱而引起肝内脂质异常沉积，是NAFL发生发展的重要分子机制之一。肝X受体（liverX receptors，LXRs）参与肝内胆固醇、胆汁酸和脂肪酸等多种脂质代谢，是肝内关键核受体，具有促胆固醇降低和脂肪酸、甘油三酯合成增加的双重效应。研究LXRs对甘油三酯合成相关靶基因的调控机制，对于研究LXRs如何引起脂代谢紊乱、造成肝内脂质沉积和促进NAFL发生发展具有重要意义，同时也可以由此找到使胆固醇降低相关靶基因激活的同时，抑制甘油三酯合成相关靶基因表达的方法，从而解决LXRs的双重矛盾效应。任何信号分子作用于基因组DNA转录调控元件之前或同时一定会伴有局部染色质的重塑，以促进基因的转录激活或抑制，因此染色质重塑被认为是基因转录调控中细胞信号转导过程的最终环节。染色质重塑包括组蛋白翻译后修饰和核小体重构两种形式，都是由具有酶活性的染色质重塑因子参与完成。LXRs对脂代谢靶基因的转录调控也是转录因子依赖的信号转导过程，理论上应该存在其靶基因上染色质重塑事件的发生，并参与LXRs对靶基因的调控。目前国内外尚无与LXRs相关的染色质重塑事件的报道，因此本课题期望通过对受LXRs调控，促进肝内甘油三酯合成而引起肝内脂质沉积的关键靶基因――脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）基因启动子转录调控区上发生的与LXRs诱导转录相关的染色质重塑事件进行研究，观察是否有染色质重塑参与了LXRs对FAS基因的转录调控，进而阐明染色质重塑是参与NAFL发生发展的重要分子机制，同时也为寻找染色质重塑因子激活剂或抑制剂用于解决LXRs在脂代谢中的双重效应提供理论依据。方法：一LXRs激动剂作用下，HepG2细胞内FAS mRNA转录表达时间谱1. LXRs激动剂T09013171uM诱导HepG2细胞脂变模型的鉴定LXRs激动剂T09013171uM作用HepG2细胞48h后，通过甘油三酯测定、油红O染色检测细胞内甘油三酯浓度大小和脂质沉积情况。2. LXRs激动剂T0901317作用下，HepG2细胞内FAS mRNA转录表达时间谱的测定分别在LXRs激动剂T0901317作用的2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h和48h时间点收集细胞总RNA，反转录为cDNA后，通过实时定量PCR检测不同时间点HepG2细胞内FAS mRNA相对表达量。二LXRs激动剂作用下，FAS基因启动子转录调控区染色质重塑1.检测LXRs激动剂作用下，FAS基因启动子转录调控区组蛋白修饰的变化状况LXRs激动剂T0901317作用细胞0min、30min、60min、120min后，通过染色免疫沉淀和实时定量PCR，利用ChIP级的抗组蛋白H3和H4乙酰化抗体，抗组蛋白H3丝氨酸10（S10）磷酸化抗体和组蛋白H3赖氨酸4（K4）三甲基化抗体，比较T0901317作用30min、60min和120min后，FAS基因转录起始点5’上游-2000bp、LXRE、转录起始点和第二外显子4个位置的组蛋白乙酰化、磷酸化和甲基化水平较0min的变化情况。2.检测LXRs激动剂作用下，FAS基因启动子转录调控区组蛋白整体水平的变化状况LXRs激动剂T0901317作用细胞0min、30min、60min、120min后，通过染色免疫沉淀和实时定量PCR，利用ChIP级的抗组蛋白H3和H4C末端抗体（与修饰后的N末端不反应，反映组蛋白的整体水平），比较T0901317作用30min、60min和120min后，FAS基因转录起始点5’上游-2000bp、LXRE、转录起始点和第二外显子4个位置的组蛋白H3和H4整体水平较0min的变化情况。三FAS基因启动子转录调控区染色质重塑为LXR-α所依赖1.检测LXR-α基因沉默对FAS基因启动子转录调控区染色质重塑的影响首先将3条LXR-α shRNA质粒转染HepG2细胞，以加入阴性质粒和不加任何质粒的细胞作为对照，24h后通过RT-PCR和Western blot比较LXR-α mRNA和蛋白质表达水平，选择出沉默效果最佳的LXR-αshRNA质粒。然后将沉默效果最佳的LXR-α shRNA质粒和阴性质粒转入HepG2细胞24h后，分别在LXRs激动剂T0901317作用2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h和48h时收集两组细胞总RNA，反转录为cDNA后，用实时定量PCR比较两组细胞不同时间点FAS mRNA的相对表达水平。最后将沉默效果最佳的LXR-α shRNA质粒和阴性质粒转入HepG2细胞24h后，用LXRs激动剂T0901317作用30min，比较沉默组和阴性质粒组HepG2细胞中FAS基因转录启动子转录调控区组蛋白H3和H4乙酰化、H3（S10）磷酸化、H3（K4）三甲基化及组蛋白H3和H4整体水平的差别。2.检测LXR-α基因过表达对FAS基因启动子转录调控区染色质重塑的影响首先将LXR-α cDNA重组表达质粒转染HepG2细胞，以加入空白质粒和不加任何质粒的细胞作为对照，24h后通过RT-PCR和Westernblot比较LXR-α mRNA和蛋白质表达水平来检测HepG2细胞中LXR-α基因过表达效果。然后将LXR-α cDNA重组表达质粒转染HepG2细胞后，分别于12h、24h、36h、48h收集细胞总RNA，反转录为cDNA后，用实时定量PCR比较不同时间点细胞中FAS mRNA相对于空白质粒细胞的表达水平。最后将LXR-α cDNA重组表达质粒转染HepG2细胞12h、24h、36h后，检测不同时间点细胞FAS基因启动子转录调控区组蛋白H3和H4乙酰化、H3（S10）磷酸化、H3（K4）三甲基化及组蛋白H3和H4整体水平相对于转入空白质粒细胞中的变化情况。四组蛋白乙酰转移酶抑制剂garcinol对LXRs诱导FAS基因转录表达的抑制首先通过MTT检测不同浓度garcinol作用下，HepG2细胞的生存率，选择出最适宜的药物作用浓度。然后用最佳浓度的garcinol和T0901317共作用于HepG2细胞30min后检测FAS基因启动子转录调控区组蛋白H3和H4乙酰化水平的变化。最后通过实时定量PCR和Western blot比较最佳浓度的garcinol和T0901317共作用于HepG2细胞相对于T0901317单独作用细胞中FAS基因mRNA和蛋白质表达水平的变化。结果：一LXRs激动剂作用下，HepG2细胞内FAS mRNA转录表达时间谱1.1uM LXRs激动剂T0901317作用下，HepG2细胞内甘油三酯合成增加，细胞内脂质明显沉积。2.1uM LXRs激动剂T0901317诱导下，4h、6h、8h、12h、16h、24h和48h组与未处理组（0h组）比较，FAS mRNA水平呈时间依赖性增高，16h时水平最高，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。二LXRs激动剂作用下，FAS基因启动子转录调控区的染色质重塑1.在LXRs诱导的FAS基因转录前期（T0901317作用2h前），其启动子转录调控区5500bp范围均有不同程度组蛋白乙酰化、磷酸化和三甲基化修饰的改变，以T0901317诱导30min时，发生在LXR反应元件（LXRE）这一重要转录调控元件上的变化最为显著，表现为组蛋白H3和H4乙酰化及H3（K4）三甲基化水平增高，H3（S10）磷酸化水平降低；转录起始点、5’上游-2000bp和第二外显子区也伴随有不同程度的乙酰化、甲基化和磷酸化改变。2.在LXRs诱导的FAS基因转录前期（T0901317作用2h前），其启动子转录调控区5500bp范围存在组蛋白H3和H4整体水平的改变。整个转录调控区上组蛋白H3和H4的整体水平都明显受到T0901317作用影响：诱导30min时，两种组蛋白水平都增高，以H3最明显，诱导60-120min后，H3水平以增高为主，H4主要表现为降低。三FAS基因启动子转录调控区染色质重塑为LXR-α所依赖1.构建的3组LXR-α shRNA质粒中，LXR-α shRNA质粒1的沉默效果最佳。LXR-α基因沉默后FAS mRNA转录水平不仅较沉默前降低，而且一直在0h基础水平波动。与未沉默组比较，沉默组FAS mRNA水平的降低从6h开始有统计学意义（P<0.05），其中12h和16h的差异最为显著（P<0.01）。LXR-α基因沉默能引起FAS基因启动子转录调控区组蛋白H3和H4乙酰化、组蛋白H3（K4）三甲基化水平及组蛋白H3和H4整体水平较沉默前不同程度改变，且LXRE位置的变化最大；组蛋白H3（S10）磷酸化水平在LXR-α基因沉默前后无明显变化。2．构建的LXR-α cDNA重组表达质粒能提高HepG2细胞内LXR-αmRNA和蛋白质的表达。LXR-α cDNA重组表达质粒转染细胞后，从24h起FAS mRNA水平呈时间依赖性增高，其中36h和48h的水平与0h相比，有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。LXR-α基因过表达诱导的FAS转录激活过程中，存在组蛋白H3和H4乙酰化，组蛋白H3（K4）三甲基化修饰及组蛋白H3和H4整体水平的变化，且这些改变与LXRs激动剂T0901317作用下的变化趋势是一致的；组蛋白H3（S10）磷酸化水平有轻微的改变，但与LXRs激动剂T0901317作用下的变化趋势完全不同。四组蛋白乙酰转移酶抑制剂garcinol对LXRs依赖FAS基因转录表达的抑制5uM、10uM、20uM和50uM garcinol作用于HepG2细胞时，存活率分别为79.45％、49.05％、9.5％和8.1％；10uM及以上浓度与空白组比较，降低有显著性差异（P<0.05，P<0.001），5uM药物浓度对细胞的影响最小。5uM garcinol与T0901317共作用后，FAS基因启动子转录调控区4个位点组蛋白H3和H4乙酰化水平都较T0901317单独作用下的水平降低，差异均有显著性（P<0.05），LXRE和转录起始点的变化最明显（P <0.01），还低于空白组基础水平。Garcinol对LXRs诱导下FAS基因mRNA表达的抑制作用从12h开始，16h达顶峰，一直持续到48h，差异均有统计学意义（P <0.05）；对蛋白质表达的抑制作用从24h开始，48h最强，差异均有统计学意义（P <0.05）。结论：一在LXRs激动剂T0901317作用下，FAS mRNA转录水平从2h开始呈时间依赖性增高，16h为高峰，持续至48h。二LXRs激动剂T0901317作用下的FAS基因转录早期，其转录起始点上下游5500bp范围的转录调控区发生了不同程度变化的组蛋白修饰和核小体重构这两种染色质重塑事件。三通过基因沉默和基因过表达两种方法证明了与FAS转录相关的组蛋白乙酰化、甲基化以及核小体重构为LXR-α所依赖。四组蛋白乙酰转移酶抑制剂gacinol，能通过降低FAS基因转录调控区组蛋白乙酰化水平来下调LXRs诱导的FAS基因转录和表达。