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供体细胞不完全重编程被认为是体细胞核移植效率低下的主要原因,甲基转移酶1(Dnmt1)和甲基转移酶3b(Dnmt3b)在早期胚胎发育中的正确表达对胚胎后期发育有重要影响。研究发现这两种酶在胚胎附植前表达较少,而体细胞核移植胚胎中表达比体内正常胚胎高。在癌细胞的研究中发现,同时干扰两者更能降低基因组甲基化水平,而在体细胞中同时干扰Dnmt1、Dnmt3b会给细胞带来何影响还未见报道。本实验以小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)为实验对象,用RNA干扰(RNAi)方法对MEF Dnmt1和Dnmt3b进行干扰,研究分别干扰和同时干扰这两个基因对细胞凋亡、周期、甲基化水平的影响。实验组随机分为Dnmt1干扰组(80n M)、Dnmt3b干扰组(80n M)、NC-Dnmt1/Dnmt3b组(80n M)、Dnmt1+Dnmt3b干扰组(80+80n M)、NC-Dnmt1+Dnmt3b(80+80n M)及空白对照组;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测Dnmt1、Dnmt3b和PCNA(proliferating cell nuclear antigen,增殖细胞核抗原)m RNA表达;蛋白免疫印记(Western Blot)检测各实验组DNMT1、DNMT3b蛋白变化情况;用凋亡、周期试剂盒分别检测细胞凋亡、周期情况;DNA甲基化定量检测试剂盒检测细胞基因组DNA总体甲基化水平。主要结果如下:1.干扰后24h,提取细胞总RNA进行q-PCR检测m RNA水平发现,与阴性对照组(NC)比较,单独干扰Dnmt1使其m RNA下降69.6%,单独干扰Dnmt3b使其m RNA水平下降63.1%;与同时干扰组的NC相比,同时干扰组Dnmt1 m RNA下降60.1%,Dnmt3b m RNA下降63.4%;Dnmt1干扰显著降低了单独干扰组DNMT1蛋白约48%(P<0.01),干扰Dnmt3b也使其同时干扰组蛋白表达下降20%(P<0.01);2.干扰后24h,Dnmt3b干扰组PCNA m RNA水平显著降低(P<0.05),同时干扰组PCNA m RNA下降极显著(P<0.01)。推测干扰Dnmt3b以及同时干扰Dnmt1和Dnmt3b抑制了MEFs细胞增殖;3.干扰后48h用流式细胞仪检测细胞凋亡变化,与NC组相比,干扰Dnmt3b显著诱导细胞凋亡(P<0.05),同时干扰组显著诱导中晚期凋亡和总凋亡(P<0.01);同时干扰组p53蛋白表达显著升高(P<0.05);4.检测si RNA干扰后48h对MEFs细胞周期影响发现,同时干扰组处于G1期、G2期细胞增加,S期细胞减少(P=0.087),差异不显著;5.检测转染后48h基因组DNA甲基化水平发现,单独干扰Dnmt3b使基因组甲基化水平下降32%(P<0.01),同时干扰组基因组甲基化水平下降约44%,差异极显著(P<0.01)。干扰Dnmt1没有使基因组甲基化水平下降。