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猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪的一种流行广、高度接触性的烈性传染病。尽管许多国家采取了控制与扑灭猪瘟的措施,但由于目前生猪贸易全球化和养猪业集约化,猪瘟迄今仍然是威胁养猪业的头号传染病之一。随着猪瘟兔化弱毒疫苗的研制成功和广泛应用,猪瘟从频繁的大流行转为无规律的区域散发,病程也由急性转为慢性,出现了非典型性猪瘟。发病对象主要是妊娠母猪和幼龄仔猪,出现了病毒的持续感染、妊娠母猪的带毒综合症、母猪繁殖障碍、出生仔猪先天性震颤、免疫猪群也发生猪瘟等特点。为了建立一个准确快速的诊断方法,分析我国目前使用的疫苗株的抗原基因是否发生了变异以及进一步建立能够鉴别感染猪体内是否是由疫苗免疫所产生抗体的方法,本研究初步建立了检测CSFV的RT-PCR方法、获得了E2蛋白的抗原决定区域的基因,并成功构建了该基因的原核表达重组质粒。首先,根据Gen Bank中登录的猪瘟病毒基因组序列和在前人研究成果的基础上,设计了一对引物,PC:5’-CGGAGGGACTAGCCRTAGTGG-3’,PD:5’-GTACACCGG TTCCTCCACTCCCAT-3’。分别以感染CSFV疫苗株的兔脾、PK-15细胞、犊牛睾丸细胞、乳猪原代肾细胞和乳兔原代肾细胞以及感染细胞培养上清为材料抽提总RNA,然后进行RT-PCR扩增。实验证明以感染兔脾直接抽提的总RNA与收集的PK-15细胞、犊牛睾丸细胞的感染上清经离心后抽提的总RNA为模板,能够较好的扩增出大小约为326bp的基因片段(记为PCD)且与已登录的该段基因大小一致。经单酶切鉴定,片段中存在预期的酶切位点。将其连接到PMD 18-T Vector上,经蓝白斑筛选、菌液PCR和质粒PCR鉴定后测序。序列分析表明,PCD与登录号为AF531433、AY805221、AY382481、AF091507和Z46258的弱毒株的同源性分别为99.4%、99.4%、99.1%、98.5%和97.8%;与登录号为M31768和AF091661的Brescia强毒株的同源性分别为96.3%和98.5%;与登录号为X87939的Alfort/187强毒株的同源性为98.2%。这表明本实验已成功地扩增了目的基因,初步建立了检测猪瘟病毒的RT-PCR方法。其次,根据Gen Bank中登录的CSFV基因组序列及原核表达质粒pGEX-4T-1的多克隆位点,设计了一对E2抗原区域的原核表达引物,A:5’-CGGAATTCTTAACT AGGGTCTGGAATAGCG-3’,B:5’-GCGTCGACCCACTGGCTCGCCTTTCACA-3’。为了便于基因的克隆与表达,我们在引物的5’端添加了酶切位点及其保护碱基。应用RT-PCR技术,从感染的PK-15细胞培养上清中扩增获得了大小约为703bp的基因片段（记为PE2）,与预期片段大小一致。经单酶切鉴定,片段中亦存在预期的酶切位点。将其连接到PMD 18-T Vector上,经菌液PCR和质粒PCR鉴定后测序。序列分析表明,PE2核苷酸序列与登录号为AF531433、AY805221、AY382481、AF091507、Z46258、M31768、AF091661以及X87939的各株该部分的序列的同源性依次为99.6%、99.4%、99.1%、96.0%、98.9%、89.9%、92.6%、95.6%,碱基的不同随机的分布于整个序列,无碱基的缺失,无碱基的插入;推导的氨基酸的序列同源性分别为100%、99.6%、99.6%、95.3%、99.6%、90.2%、92.3%、96.2%。最后,为了获得PE2蛋白为制备单抗等深入研究,我们应用DNA重组技术,将PE2基因亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21菌株。经菌液PCR、质粒PCR与双酶切鉴定后,筛选获得阳性克隆pGEX-4T-1-PE2。综上所述,本研究初步建立了检测猪瘟病毒的RT-PCR方法和克隆了猪瘟病毒疫苗株的E2蛋白抗原区域（PE2）,并进一步成功地构建了PE2的原核表达重组质粒。所有这些将为猪瘟及猪瘟病毒的深入研究奠定一定的实验基础。