虫媒病毒是指通过吸血节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而传播疾病的一类病毒,目前国际上已经发现500余种虫媒病毒,其中有100多种与人畜疾病关系密切,感染后可表现为发热、出疹、关节炎、出血和脑膜脑炎,严重的可以引起死亡。许多新发传染病如西尼罗热和裂谷热也都属于虫媒病毒病。因此,虫媒病毒及虫媒病毒病已经成为国际社会关注的热点公共卫生问题。自20世纪50年代以来已经证实4种虫媒病毒及相关疾病在我国存在与流行,即乙型脑炎病毒、森林脑炎或称春夏季脑炎病毒、新疆出血热病毒和登革热病毒1～4血清型。我国幅原辽阔,媒介昆虫众多,我国的虫媒病毒肯定远远不止目前已知的几种,但是缺乏相应的背景调查。本研究于2006～2008年对我国山西、甘肃和江西三省开展虫媒病毒调查,在7～8月蚊虫高发季节采集蚊虫标本,通过组织培养方法分离病毒,对分离到的病毒采用血清学和分子生物学等方法进行鉴定,以明确当地存在虫媒病毒的种类及分布特点。本研究在完善我国虫媒病毒背景资料,并为虫媒病毒病的预防和控制提供病原学依据等方面都具有重要的流行病学意义。1.山西省虫媒病毒分离鉴定2006～2007年夏季在山西省运城市、临汾市、阳泉市和忻州市的七个县区采集4属7种共17860只蚊虫标本,包括2种库蚊、3种伊蚊、1种按蚊和1种阿蚊。将蚊虫标本分为144批进行研磨处理,通过组织细胞培养法得到15株阳性分离物。血清学鉴定结果显示,有8株分离物仅能与版纳病毒特异性免疫腹水发生反应;有2株分离物除了能和版纳病毒特异性免疫腹水发生反应外,还能够与辽宁病毒特异性免疫腹水发生反应;其余5株分离物与常见的虫媒病毒抗体发生均不发生反应。分子生物学鉴定结果进一步证实15株阳性分离物中有10株版纳病毒(Bannavires,BAV),2株辽宁病毒(Liaoning virus,LNV),3株淡色库蚊浓核病毒(Culexpipiens pallens densovirus,CppDNV)及2株有待进一步的鉴定的病毒分离物。10株BAV中有6株分离自淡色库蚊,有1株分离自背点伊蚊,其余的3株分离自混合蚊种。2株LNV分别分离自淡色库蚊和背点伊蚊。3株CppDNV中有2株分离自淡色库蚊,有1株分离自骚扰阿蚊。新分离病毒分子生物学特征分析显示,10株BAV之间第12片段编码区序列高度同源,核苷酸同源性为98.7%～100%,氨基酸同源性为98.1%～100%;与版纳病毒标准株(BANNA)相比,第12片段核苷酸同源性在90.5%～91.2%之间,氨基酸同源性在93.2%～94.2%之间。系统进化分析提示山西省分离的10株病毒位于独立的进化分支中,显示出明显的地域性特点。2株LNV之间第10片段部分核苷酸同源性为100%,与辽宁病毒标准株(LNV-NE97-31)同源性最低,仅为76.7%。系统进化分析显示除LNV-NE97-31外,中国其他地区的分离株均位于同一个进化分支中,山西分离株和新疆分离株第10片段进化都相对独立,表现出了LNV进化过程中的地域性。对CppDNV非结构蛋白NS1和NS2的部分核苷酸序列分析显示,3株山西省新分离株的同源性为100%;与我国其他省市的分离株同源性很高,在99.9%～100%之间。系统进化分析提示所有中国分离株均位于一个相对独立的进化分支中,并且与AaeDNV的进化关系较近。本研究分离到的BAV、LNV和CppDNV病毒均为山西省首次报道。2.甘肃省虫媒病毒分离鉴定2008年7～8月间在甘肃省张掖市、酒泉市、嘉峪关市、白银市和平凉市五个标本采集点共采集13839只蚊虫标本,蚊种包括库蚊、伊蚊和按蚊3属。将蚊虫标本分为280批进行研磨处理,利用组织培养方法得到6株阳性分离物。血清学鉴定结果显示6株分离物均能够与乙脑病毒特异性抗体发生反应,分子生物学鉴定结果进一步证实6株病毒均为乙脑病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV),所有毒株均分离自库蚊标本。分子生物学特征分析显示,6株JEV均为基因Ⅰ型乙脑病毒。6株JEV新分离株之间E基因序列同源性很高,核苷酸同源性为98.1%～99.9%,氨基酸同源性为99.6%～100%;与疫苗株SA14-14-2相比,E基因核苷酸同源性为87.5%～87.9%,氨基酸同源性为96.8～97.2%。新分离株与疫苗株在E基因区段存在11处共同氨基酸位点差异,但这些位点均不处于决定抗原性的关键氨基酸位点。系统进化分析显示2008年甘肃JEV新分离株与2004年四川分离株和2005年上海分离株进化关系较近。甘肃省既往虫媒病毒调查仅局限在陇南地区,西北部地区从未涉及。本研究首次在甘肃省东部白银市和西北部地区张掖市、酒泉市和嘉峪关市开展虫媒病毒调查,并在白银市分离到6株基因Ⅰ型乙脑病毒,这是在该地区首次分离到乙脑病毒,并提示基因Ⅰ型乙脑病毒已经传播到我国西北内陆地区。3.江西省虫媒病毒分离鉴定2008年7～8月间在江西省吉安市、赣州市、宜春市、抚州市和上饶市五个地区共采集11916只蚊虫标本,隶属于3属3种,包括三带喙库蚊、中华按蚊和骚扰阿蚊。将蚊虫标本分为240批次进行研磨处理,通过组织培养法得到14株阳性分离物。14株阳性分离物均只能够引起BHK-21细胞产生病变,而对C6/36细胞无致病变效应。通过血清学和分子生物学初步鉴定,14株阳性分离物基本可以排除甲病毒、黄病毒、布尼亚病毒的可能,也可以排除dsRNA病毒的可能,进一步的鉴定工作及其与疾病关系的研究正在进行中。在蚊虫标本采集点当地县医院采集331份发热病人血清标本,使用乙脑IgM抗体ELISA试剂盒检测血清标本中的乙脑IgM抗体,共检测到4份阳性标本,其他引起脑炎与发热病原体感染的研究正在进行中。本课题的意义本研究于2006～2008年在我国山西、甘肃和江西三省开展虫媒病毒调查,共采集43615只蚊虫标本,隶属于4属7种,包括2种库蚊、3种伊蚊、1种按蚊和1种阿蚊。所有标本分为664批进行研磨处理,通过组织培养技术共分离到21株病毒分离物,经血清学和分子生物学鉴定,病毒隶属于3科4种,包括呼肠孤病毒科Seadornavirus属BAV病毒(10株)及LNV病毒(2株),细小病毒科短颈浓核病毒属CppDNV病毒(3株)和黄病毒科黄病毒属JEV病毒(6株)。这些数据不仅填补和丰富了上述地区虫媒病毒的基线数据,更重要的是为当地虫媒病毒病的预防控制及夏秋季不明原因发热病例的诊断提供了重要的依据和信息,为深入研究我国虫媒病毒的分布及相关疾病的发生、发展和流行特征积累了资料。