前言:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)引起的神经功能缺失和缺乏有效的治疗手段,一直是对人类健康的极大挑战。脊髓损伤后,胶质瘢痕修复损伤部位,但过度增生的瘢痕组织被认为是阻碍轴突再生的重要原因,且与炎症细胞的激活以及抑制性细胞外基质的分泌密切相关。星形胶质细胞受到炎症因子激活后形成反应性胶质细胞增生并导致胶质瘢痕的形成,胶质瘢痕又可以分泌炎症因子和细胞外抑制性基质成分,加重了继发性损伤,导致恶性循环。因此,抑制胶质瘢痕的形成是提高脊髓损伤神经功能恢复的重要策略。取自姜科姜黄属多年生草本植物姜黄干燥梗茎中的姜黄素(curcumin,cur),作为香料和食用色素很早就得到了广泛应用。大量的研究证实,姜黄素能通过调节转录因子、生长因子、趋化因子、炎症因子和酶等发挥抗炎、抗纤维化、抗肿瘤等生物学功能。我们前期的研究发现姜黄素可以抑制胶质瘢痕的形成,但其作用机制和作用靶点仍需要进一步探讨。炎症反应是导致继发性脊髓损伤的重要因素。小胶质细胞作为中枢神经系统常驻免疫细胞,在脊髓损伤后迅速激活并持续分泌促炎因子,是介导脊髓损伤后炎症反应的重要成分。抑制小胶质细胞的激活可以显著提高实验动物脊髓损伤后运动功能的恢复。姜黄素能抑制颅脑损伤后的小胶质细胞的活性,但其在脊髓损伤后小胶质细胞活化中的作用缺乏深入的研究。炎症反应还和神经干细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)的增殖与分化密切相关。抑制炎症反应可以促进NSPCs分化为神经元和少突胶质细胞。基于以上理论,我们进行了如下假设:姜黄素能抑制星形胶质细胞和小胶质细胞介导的炎症反应,脊髓损伤后其发挥强大的抗炎作用,有助于脊髓损伤后神经功能恢复。控制脊髓损伤的炎症反应能改善NSPCs生长的环境,这对NSPCs分化为神经元和少突胶质细胞具有积极作用。本课题从以下几个方面进行了研究。一.姜黄素抑制脊髓损伤后胶质瘢痕形成目的:脊髓损伤能激活胶质细胞并使其肿胀、增殖,形成反应性胶质细胞增生,严重压缩了神经生长的空间。胶质细胞还会分泌大量抑制性细胞外基质,改变轴突生长的微环境。这些共同作为胶质瘢痕的抑制因素,严重阻碍了神经再生。本研究通过建立脊髓损伤模型后给予姜黄素干预,检测其对胶质瘢痕的作用。材料与方法:1.采用sd大鼠建立脊髓夹伤模型,给予不同浓度姜黄素(300mg/kg、100mg/kg、30mg/kg)连续干预7天,并以甲基强的松龙作为对照;2.在损伤8周后,采用bbb评分、斜板实验和bda染色评估神经功能恢复情况;3.在损伤8周后,通过he染色和mri检测不同干预条件下脊髓空洞体积;4.在损伤2周后,采用免疫组织化学染色观察了胶质瘢痕细胞内外成分胶原纤维酸性蛋白(gfap)和硫酸软骨蛋白多糖(cspg)表达情况;5.在损伤2周后,采用elisa和pcr检测了瘢痕组织中相关炎症因子表达情况。结果:1.姜黄素处理组中bbb评分、斜板实验和bda染色均优于对照组,并且随着浓度增加效果增强,姜黄素300mg/kg实验组效率最好;2.姜黄素能显著抑制脊髓损伤8周后胶质瘢痕形成;3.姜黄素能抑制胶质瘢痕细胞内gfap和细胞外cspg成分;4.姜黄素能抑制胶质瘢痕中炎症因子表达。结论:姜黄素能促进脊髓损伤后大鼠神经功能恢复。姜黄素通过抗炎作用抑制胶质瘢痕细胞内成分gfap表达。姜黄素通过抑制转录因子减少胶质瘢痕细胞外成分cspg表达。联合抑制细胞内外成分是姜黄素发挥抑制胶质瘢痕形成的作用机制。二.姜黄素对星形胶质细胞的作用及机制目的:通过在体和离体实验,探讨姜黄素干预下星形胶质细胞在炎症反应与纤维化过程中表型的转变以及其与胶质瘢痕细胞内外成分gfap和cspg表达的相互关系。材料和方法:1.使用sd大鼠建立脊髓损伤模型并给予300mg/kg姜黄素连续干预7天,采用姜黄素溶剂dmso作为对照;2.通过体外培养原代星形胶质细胞,并使用sirna干扰nf-κb亚基p65和sox9基因,采用emsa、wb和pcr检测干扰效率;3.使用免疫荧光、wb和pcr检测胶质瘢痕细胞内成分gfap表达和nf-κb信号通路的相互关系,elisa检测星形胶质细胞中趋化因子表达情况,流式细胞技术检测胶质瘢痕中t淋巴细胞和巨噬细胞的数量;4.使用免疫荧光、wb和pcr检测胶质瘢痕细胞内基质cspg表达和sox9的相互关系,以及纤维化相关分子α-sma表达情况。结果:1.姜黄素能抑制nf-κb信号通路成分p-ikk-α、p-ikk-β、p-iκb-α和p65表达,上调nf-κb抑制性分子iκb-α表达,从而抑制星形胶质细胞活化;2.姜黄素能通过调控nf-κb信号通路抑制星形胶质细胞释放趋化因子mcp-1、rantes和cxcl10,3.姜黄素能通过调控nf-κb信号通路减少胶质瘢痕中t淋巴细胞和巨噬细胞浸润;4.姜黄素抑制转录因子sox9表达,减少胶质瘢痕细胞外基质成分cspg沉积;5.姜黄素能通过调控sox9通路,抑制纤维化相关分子α-sma表达。结论:姜黄素通过干预nf-κb信号通路抑制星形胶质细胞的活性,抑制其分泌趋化因子,从而减少胶质瘢痕中巨噬细胞和t淋巴细胞浸润,减轻星形胶质细胞介导的炎症反应。姜黄素通过调控sox9信号通路抑制星形胶质细胞纤维化,减少细胞外基质成分cspg沉积。姜黄素能通过联合发挥抗炎抗纤维化作用,有效抑制脊髓损伤后胶质瘢痕细胞内外成分,有利于脊髓损伤后神经功能恢复。三.姜黄素对小胶质细胞的作用及机制目的:本研究使用核因子e2-转录相关因子-2(nrf2)基因敲除小鼠nrf2(-/-)和野生型小鼠nrf2(+/+),建立脊髓损伤模型或lps诱导原代小胶质细胞,并给予不同浓度姜黄素干预后,探讨了姜黄素在脊髓损伤后小胶质细胞活化中的作用及其机制。材料和方法:1.使用nrf2(+/+)和nrf2(-/-)小鼠,建立脊髓损伤模型,给予不同浓度姜黄素(100mg/kg,50mg/kg,25mg/kg)连续干预7天;2.采用wb检测脊髓损伤后28天内小胶质细胞活性与nrf2表达之间的关系;3.体外培养原代小胶质细胞,lps刺激后给予姜黄素或erk抑制剂u0126干预;4.采用免疫荧光、wb、pcr、流式细胞技术检测了脊髓损伤后7天时损伤组织中小胶质细胞的活性以及和nrf2之间的关系;5.采用wb检测了nrf2下游erk/stat3/p65表达情况。结果:1.脊髓损伤后nrf2和inos表达即可升高,并于伤后第7天时达到峰值;2.在体实验发现姜黄素干预后能促使小胶质细胞中nrf2由胞浆转运到胞核中,抑制inos表达,抑制小胶质细胞活性,且存在浓度依赖性,nrf2基因敲除后废除了姜黄素对小胶质细胞的抑制作用;3.离体实验显示,姜黄素干预nrf2(+/+)小胶质细胞后,p-erk和inos表达均下降,而nrf2(-/-)小胶质细胞中p-erk表达没有改变;4.erk抑制剂u0126可以抑制nrf2(-/-)小胶质细胞中erk磷酸化并减少下游p-stat3和p-p65表达;5.姜黄素能调节小胶质细胞中nrf2/erk/p65信号通路。结论:姜黄素抑制脊髓损伤后小胶质细胞的活性,通过减轻小胶质细胞介导的炎症反应发挥神经保护作用。姜黄素抑制小胶质细胞激活是通过调控nrf2/erk/p65通路实现的。四.控制炎症反应后对神经干细胞再生的影响及机制目的:神经干细胞(neuralstem/progenitorcells,nspcs)具有自我增值及分化为中枢神经系统神经细胞的潜能,,是神经损伤后细胞替代疗法的重要细胞来源。如何诱导nspcs定向分化为神经元和少突胶质细胞,是神经科学领域研究的重点和难点,也是热点之一。本研究中我们通过体外培养小胶质细胞并诱导其分化为m1型和m2型,而后观察各细胞上清诱导nspcs分化情况,阐述不同表型的小胶质细胞在nspcs分化中的作用及其机制。材料与方法:1.体外培养小胶质细胞,给予不同干预诱导小胶质细胞表型转变,采用免疫荧光、WB和PCR检测M1和M2型小胶质细胞标记物表达情况;2.收集不同表型小胶质细胞上清制成NSPCs诱导分化培养基并诱导NSPCs分化,采用免疫荧光和WB检测神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化比例;3.采用液相色谱—质谱分析和ELISA实验检测M2型小胶质细胞PPARγ和15d-PGJ2表达情况;4.给予PPARγ抑制剂GW9662干预NSPCs分化后,采用免疫荧光和WB检测神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的分化比例;5.WB检测NSPCs中PPARγ和β-catenin表达情况。结果:1.LPS+IFN-γ诱导小胶质细胞表型转变为M1型,IL-4诱导小胶质细胞表型转变为M2型;2.M2型小胶质细胞上清诱导NSPCs分化为神经元和少突胶质细胞的比例升高,分化为星形胶质细胞的比例减少;3.M2型小胶质细胞中PPARγ和15d-PGJ2表达与M0和M1型相比较显著升高;4.抑制NSPCs中15d-PGJ2的受体PPARγ会减少神经元和少突胶质细胞分化比例,促进星形胶质细胞分化;5.M2小胶质细胞上调NSPCs中PPARγ和β-catenin表达。结论:M2型小胶质细胞可以增加NSPCs分化为神经元和少突胶质细胞的比例,减少星形胶质细胞分化数量。M2型小胶质细胞促进NSPCs分化是通过激活PPARγ/β-catenin信号通路实现的。综上结果表明,姜黄素能抑制星形胶质细胞和小胶质细胞介导的炎症反应,同时还能抑制星形胶质细胞纤维化。姜黄素通过联合发挥抗炎抗纤维化作用,同时抑制脊髓损伤后胶质瘢痕细胞内外成分。姜黄素控制炎症反应后,显著改善了神经干细胞的生长环境,有利神经干细胞分化为神经元和少突胶质细胞,促进了脊髓损伤后神经功能恢复。