蛋白质的糖基化修饰有多种方式,其中O-糖基化修饰是其重要的组成部分。而要研究O-糖基化修饰对蛋白质的影响,糖链结构的分析必不可少。要分析糖链,首先要将糖链从蛋白质上解离下来。目前将糖链从蛋白质上解离下来的方法有肼解法、β-消除法,生物解离法和酶解法。前三种方法都有明显的局限性,而酶解法可以避免这些缺点,因此对N-乙酰氨基半乳糖苷酶(Endo-α-N-acetylgalactosaminidase)的研究有着重要的意义。目前,N-乙酰氨基半乳糖苷酶研究并不多,对这种酶商业化的应用更为罕见。因此,发掘具有高度底物特异性的,并且可以通过大肠杆菌进行异源表达的重组N-乙酰氨基半乳糖苷酶,对糖链结构的分析以及其在O-糖基化修饰中生物学功能的研究有重要的意义。针对当前N-乙酰氨基半乳糖苷酶研究存在的问题,本实验研究利用生物工程技术从人肠道微生物Tyzzerella nexilis中发掘新的N-乙酰氨基半乳糖苷酶,并对其活性以及生化特性进行检测。1、本研究从革兰氏阳性杆菌属Tyzzerella nexilis(DSM 1787)中发掘三种编码N-乙酰氨基半乳糖苷酶基因。将这三种基因利用分子生物学技术进行基因克隆,构建重组表达载体,并重组表达载体导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。在特定的培养和诱导条件下可以在短时间内获得大量的重组N-乙酰氨基半乳糖苷酶。所得的重组N-乙酰氨基半乳糖苷酶在经过镍亲和柱(Ni-NTA)进行分离和纯化后,经SDS-PAGE验证,可以得到纯度相对较高的重组N-乙酰氨基半乳糖苷酶。2、经诱导表达后从菌株E.coli BL21(DE3)获得的酶粗提液以pNP-core 1为底物,根据颜色反应初步检测酶活性。酶经镍亲和柱(Ni-NTA)纯化后,使用不同的O-聚糖结构为底物(pNP-core 1,pNP-core 2,pNP-α-GalNAc,pNP-β-GalNAc,pNP-α-galactose 和 pNP-β-galactose)测定其酶活特异性,Tn0153 和 Tn2105 对 pNP-core 1有水解活性,而Tn1787对pNP-core 1没有活性。Tn2105只特异性的作用于pNP-core 1,而Tn0153除作用于pNP-core 1以外,还能对pNP-a-GalNAc有水解活性,但是活性较低。3、用改良型的brad试剂盒测出纯化后的重组酶中的酶蛋白含量,每次使用定量的重组N-乙酰氨基半乳糖苷酶和pNP-core 1来测定酶本身所具有的生化特性。实验结果表明,Tn0153和Tn2105在酸性环境中活性最高,最适pH均为pH4.0。Tn0153和Tn2105的最适反应温度为50℃。Cu2+完全抑制Tn0153和Tn2105的活性,加入Zn2+时Tn0153的活性也完全被抑制。每种添加物对Tn0153和Tn2105活性有一定的影响。结果发现,SDS和咪唑对这两种酶活性的抑制是最明显的。值得注意的是,终浓度为200 mM的咪唑使Tn0153完全失去了活性。综上所述,Tyzzerella nexilis源的两个N-乙酰氨基半乳糖苷酶基因的成功克隆并利用大肠杆菌重组表达系统成功得到了具有高度底物特异性的酶。本研究为O-糖基化修饰蛋白质糖链的分析提供重要的工具酶,并且为糖链对O-糖基化修饰蛋白质功能影响的研究奠定了重要的基础。