研究背景：内质网是调控蛋白质进行折叠修饰的重要细胞器,然而,在一些理化因素的作用下,内质网内环境常常发生巨大变化,引发内质网应激,进而发生未折叠蛋白反应。转录活化因子ATF6是未折叠蛋白反应中的主要信号转导分子之一,其分子大小为90kDa,可促进分子伴侣表达,提高内质网对蛋白质的转运、折叠能力。近来有研究显示肿瘤细胞由于其特殊的内外环境,常常伴随着未折叠蛋白反应的发生,且ATF6作为重要的转导分子与多种肿瘤的发生发展有着重要的联系,但其对肝细胞肝癌的作用却鲜有报道。研究目的：在肝癌细胞系中过表达ATF6基因,鉴定ATF6对肝癌细胞活性、迁移、侵袭及克隆形成能力的影响。实验方法：采用本实验室已构建的p3X-Flag-CMV-14-ATF6真核表达质粒,分别对肝癌细胞系HepG2和SMMC7721进行瞬时转染以上调ATF6基因的表达水平,同时以未经处理和转染p3X-Flag-CMV-14空载质粒的细胞作为空白对照和阴性对照。通过MTT细胞活性实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验和克隆形成实验等,探究ATF6对肝癌细胞系的影响。研究结果：在HepG2及SMMC7721细胞系中分别瞬时转染ATF6真核表达质粒后,qPCR检测,ATF6的mRNA表达水平显著升高。MTT细胞活性检测实验结果显示,上调ATF6基因表达水平后,两种细胞系的细胞活性与阴性对照组相比无明显改变。划痕实验中,上调ATF6基因表达水平可使两种细胞系的迁移距离增加。Transwell迁移实验中,上调两种细胞系的ATF6基因表达水平显著增加了Transwell下室面的细胞数量。Transwell侵袭实验中,ATF6的过表达同样显著增加了Transwell下室面上两种细胞的数量。克隆形成实验中,提高ATF6基因表达水平可提高两种细胞系克隆形成集落的数量。研究结论：在肝癌细胞系HepG2和SMMC7721中,提高ATF6的表达水平,均可显著增强细胞的迁移、侵袭及克隆形成能力,而对细胞活性无明显影响。研究背景：毒胡萝卜素是一种潜在的抗肿瘤药物,它可以通过对内质网中钙泵的抑制而引发内质网应激反应,从而有效的引发细胞凋亡。肝细胞肝癌在世界范围内属于第六大癌症,是造成肿瘤相关死亡的第三大因素。而在中国,乙肝病毒感染是造成肝癌产生的主要原因。研究目的：利用乙肝病毒呈阳性的HepG2.2.15和乙肝病毒呈阴性的HepG2的两种肝癌细胞系,探究乙肝病毒在毒胡萝卜素引发的凋亡中的作用。实验方法：首先在HepG2.2.15和HepG2中细胞分别加入毒胡萝卜素,显微镜观察0小时、24小时、48小时、72小时和96小时后细胞的形态学变化。继而通过MTT细胞活性实验和流式细胞凋亡实验确定两种肝癌细胞系经毒胡萝卜素处理后,在各个时间点细胞的凋亡情况。通过qPCR检测两种细胞在经过毒胡萝卜素处理后各个时间点内质网应激反应通路中相关基因的mRNA表达水平,确定了主要作用基因CHOP,并通过Western blotting检测CHOP蛋白质水平的表达。此外,我们用干扰素IFNa处理HepG2.2.15细胞后检测乙肝病毒被抑制时细胞凋亡情况及内质网应激通路中主要基因表达量的变化,最后我们分别在HepG2.2.15和HepG2细胞中提高和敲低CHOP基因的表达量,通过MTT实验检测两种细胞系凋亡状态发生的变化。研究结果：毒胡萝卜素处理后显微镜观察细胞显示HepG2.2.15比HepG2细胞有着更好的细胞形态。通过MTT细胞凋亡实验与流式细胞仪进一步证实在毒胡萝卜素处理后,乙肝病毒呈阴性的HepG2细胞比乙肝病毒呈阳性的HepG2.2.15细胞有更高的凋亡水平。此外,细胞周期实验显示,经毒胡萝卜素处理后,HepG2细胞中G2期细胞所占的比例高于HepG2.2.15细胞。qPCR对内质网应激通路相关基因的检测分析,确定CHOP为主要变化基因,通过Western blotting实验检测CHOP蛋白表达量的改变,进一步确认其为在HepG2中的表达量高于在HepG2.2.15中。此外,经干扰素IFNα处理的HepG2.2.15 CHOP基因表达量与未处理细胞相比CHOP表达水平增高。而分别在HepG2.2.15和HepG2细胞中提高和敲低CHOP基因的表达则会使两种肝癌细胞间凋亡差异缩小。研究结论：乙肝病毒可能通过内质网应激作用来抑制细胞凋亡。