猪Angptl家庭基因的克隆、表达及调控研究

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血管生成素相关蛋白是最新发现的一族不仅与血管生成有关,而且与脂类代谢、葡萄糖代谢和胰岛素敏感性密切相关的分泌性蛋白质因子。它们属于纤维蛋白原超家族,具有同血管生成素相似的结构特征,即N端的信号肽序列,介导同源寡聚体形成的螺旋样结构域和调节配体活性的纤维蛋白原样结构域。但是,血管生成素样蛋白不能与Tie2受体结合,所以他们不是真正意义上的血管生成素,故命名为血管生成素相关蛋白(ARP)/血管生成素样蛋白(Angptl)。本文以梅山猪为材料克隆了猪Angptl家族的5个基因,并利用辐射杂种细胞板技术和半定量RT-PCR等方法进行了染色体定位和组织表达分析;同时研究了它们在脂肪型猪(通城猪)和瘦肉型猪(长白猪)组织中的表达差异;最后以HepG2细胞为研究对象,进行了表达调控的初步研究,得到如下结果:1、利用RT-PCR、5’RACE和3’RACE方法,扩增并拼接得到Angptls全编码区的cDNA序列,其中Angptl1编码区为1476bp,编码491个氨基酸;Angptl2编码区为1482bp,编码493个氨基酸;Angptl3编码区为1389bp,编码462个氨基酸;Angptl4编码区为1239bp,编码412个氨基酸;Angptl6编码区为1362bp(非全编码区,缺5’端约30个碱基),编码453个氨基酸。2、根据已扩增的猪Angptls的cDNA序列和人Angptls的基因序列及mRNA序列,分别设计引物扩增Angptls内含子的基因片断。再根据所测内含子序列设计引物,利用辐射杂种板技术对这5个基因进行染色体定位,结果表明它们分别定位在4条染色体上,其中Angptl4和Angptl6定位于2号染色体的同一区域。上述5个基因的定位结果皆与人基因组中相应基因的染色体位置相对应。3、以梅山猪的脂肪组织、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、肠、脑、肾十个组织样品为材料,用半定量RT-PCR的方法研究了Angptls的组织表达谱。结果表明Angptl1、Angptl2和Angptl4是广谱表达,其中Angptl1在脂肪组织、胃和脾中表达量最高,Angptl2在脂肪组织和肠中高效表达,Angptl4在脂肪组织中表达最丰富。而Angptl3和Angptl6主要在肝脏中表达,另外,Angptl6在脂肪组织、胃、肠和脑组织中也有微量表达。4、以脂肪型猪(通城猪)和瘦肉型猪(长白猪)的组织样品为材料,对Angptls在两种不同类型猪中的组织表达差异进行了研究。结果显示Angptl1和Angptl2基因在通城猪肝脏和心脏中的表达量高于长白猪的相应组织,而在通城猪脂肪组织中的表达量却低于长白猪脂肪组织;Angptl3在通城猪肝脏中的表达量高于长白猪;Angptl4基因在通城猪肝脏和脂肪组织中的表达量均高于长白猪的相应组织;Angptl6基因在通城猪肝脏的表达量低于长白猪。5、以人肝瘤细胞系HepG2为材料,研究葡萄糖、胰岛素、克伦特罗和地塞米松对Angptls的调控作用。结果表明,高浓度葡萄糖(25mmol/L、50 mmol/L和100mmol/L)处理显著升高Angptl4 mRNA的表达,降低Angptl6 mRNA的表达量。胰岛素处理显著抑制Angptl3、Angptl4、Angptl6的表达量。当用相同浓度胰岛素(100nmol/L)和不同浓度葡萄糖处理时,Angptls表达量的变化趋势与不同浓度葡萄糖处理的变化趋势相似。克伦特罗处理增加Angptl3和ChREBP mRNA的表达。地塞米松处理显著增加Angptl4 mRNA的表达,降低Angptl6和ChREBP mRNA的表达量。
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