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目的超短波治疗具有消除炎症、减少水肿、促进血管舒张、改善血液循环、营养组织器官和增强组织代谢的功效,超短波对损伤组织的修复作用在康复学领域已得到证明并己被广泛应用。有研究证明,通过脱细胞支架和超短波治疗结合的方法,在修复大鼠坐骨神经损伤的治疗中起到了加速神经生长速度的作用。近年来随着组织工程学的不断发展,应用带有种子细胞的支架材料修复周围神经损伤已经日趋成熟。同种异体脱细胞神经细胞外基质材料(acellular extracellular matrix.AECM)作为有生物活性的神经替代物,具有良好的仿生性和组织相容性,移植后为轴突再生提供适宜的微环境,能够有效促进神经再生。近年来随着对骨髓问充质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)分化为施万细胞研究的日益深入,证明它具有可塑性高、免疫原性低、体外易于获得能够快速扩增和长期存活的特性,这些条件使之成为修复周围神经损伤理想的种子细胞。本实验是观察小剂量超短波对种植BMSC的脱细胞支架修复大鼠坐骨神经损伤的作用,为临床神经损伤修复和康复治疗提供实验依据。材料与方法l、脱细胞神经移植物的制备wistar大鼠,经麻醉后取出两侧的坐骨神经,采用化学萃取脱细胞方法制备脱细胞神经基质支架。2、BMSCs的分离、培养和鉴定取生后25-30天的雄性Wistar大鼠,从胫骨和股骨内分离出BMSCs,采用贴壁法纯化细胞并培养至第三代备用。取第三代BMSCs分别在成骨诱导培养液和成脂肪诱导培养液中进行培养,观察其形态的改变。茜草素红染色和油红0染色分别鉴定BMSCs向成骨和成脂肪诱导的细胞。3、实验动物和分组雄性Wistar大鼠48只,体重为200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验分为3组,即支架内注射达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium,DMEM)、支架内注射BMSCs组和注射BMSCs后应用超短波治疗组,各组分别于移植后的第2、4、8和12周各处死4只。4、脱细胞神经支架移植取第三代BMSCs,用微量注射器按照接种浓度为1×10~6个/毫升注入到制备好的支架内并置于培养箱内联合培养3天;在无菌条件下缝合联合培养的神经支架到神经缺损处。5、超短波治疗术后第二天即采用小剂量超短波对移植动物的神经缺损处治疗。6、观察指标及检测方法(1)光镜和电镜观察AECM的形态结构。(2)在倒置显微镜下观察BMSCs的细胞生长情况。(3)足迹实验检测大鼠坐骨神经功能指数(sciatic function index,SFI),跟踪观察其神经功能恢复情况。(4)甲苯胺蓝染色观察再生神经的纤维数目、轴突直径,透射电镜检测再生神经的髓鞘厚度。(5)免疫荧光染色分析再生的神经内的S-100、神经胶质酸性蛋白(Glialfibrillary acidic protein,GFAP)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)的表达。(6)RT-PCR检测再生的神经内S-100mRNA和VEGFmRNA表达。7、统计学分析。实验结果1、光、电镜观察到采用化学萃取脱细胞方法制备的AECM完整地保留了以基底膜管为主构成的三维立体结构。2、倒置显微镜下观察到贴壁的BMSC细胞呈圆形,成纤维细胞样或纺锤体样,12天后能够达到90%融合。3、用茜草素红和油红0分别对向成骨细胞和脂肪细胞诱导的BMSCs进行染色发现各自向诱导的细胞分化,即有红色的骨基质的沉积和脂滴形成。4、实验动物行走实验证明随着时间的增长SFI逐渐上升,超短波治疗组SFI上升的更快。5、再生神经的甲苯胺蓝染色和透射电镜检测显示:随着移植术后时间增长,超短波治疗组治疗组的再生神经髓鞘的厚度增加、直径增大和神经纤维数目增多。6、免疫荧光结果发现S-100蛋白和GFAP蛋白在再生的神经内都有阳性表达并且和时间成依赖性增长,在超短波治疗组的表达优于其它两组。VEGF的表达在第4周达到顶峰然后逐渐下降。7、RT-PCR检测再生的神经内S-100mRNA表达与时间增长成正比,超短波治疗组内的S-100mRNA和VEGFmRNA表达明显增多。VEGFmRNA在术后第4周表达最多。结论l、注入BMSCs的脱细胞支架对神经损伤恢复的作用要好于单纯的脱细胞支架,应用超短波治疗之后的神经功能恢复情况又好于非超短波治疗组。2、移植物内的细胞内的S-100和GFAP阳性表达证明脱细胞支架可以促进BMSC向施万细胞的分化或迁移,超短波治疗可以起到加速分化或迁移的的速度。3、移植物内VEGFmRNA和蛋白的高水平可推断超短波治疗可能促进再生神经周围的血供的增加为其提高更多的营养成分。