肺癌是世界发病率及死亡率最高的的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)患者占80-85%。分子靶向治疗已经成功应用于多种癌症的治疗,也是目前治疗NSCLC最有前景的研究领域。间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因编码的受体酪氨酸激酶在正常情况下只在发育中的中枢神经细胞中高表达。近年来在多种癌症中发现ALK基因变异,与肿瘤的发生发展密切相关。2007年首次在日本NSCLC患者中发现EML4-ALK融合蛋白的表达并确定了其致癌作用。大量研究统计发现约6%的NSCLC患者高表达EML4-ALK融合蛋白,而在中国NSCLC非吸烟患者中,EML4-ALK阳性率高达9.3%。鉴于ALK的酪氨酸激酶活性具有转化致癌作用,研发相关激酶抑制剂将为中国EML4-ALK阳性的NSCLC患者提供非常有前景的治疗。c-Met为肝细胞生长因子(HGF)受体,具有酪氨酸激酶活性。目前认为,c-Met与多种肿瘤的发生和转移密切相关。在NSCLC中,c-Met基因扩增突变达4-5%。更值得注意的是,c-Met基因或蛋白的过表达是导致患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐受的重要原因。在接受过EGFR-TKI治疗的NSCLC患者中,有高达20%的患者肿瘤组织中存在c-Met蛋白过表达或c-Met基因扩增。因此,c-Met小分子抑制剂的研发已成为探索NSCLC治疗的一大热点。鉴于ALK和c-Met在NSCLC中的重要作用,在本课题中,我们建立和确认了分子水平和细胞水平的化合物筛选平台并进行化合物筛选,期望获得较高活性的新型小分子抑制剂。通过已建立的平台,我们对双靶向ALK和c-Met的新型小分子抑制剂CM-118进行了体外药效和药理学研究,为其在中国的临床I期申报提供相关依据。另外,我们通过在HEK-293中过表达ALK,进一步探讨了ALK信号通路在肿瘤发生发展中的作用机制。第一部分ALK和c-Met新型抑制剂筛选平台的建立及化合物的筛选目的：建立ALK和c-Met的新型抑制剂筛选平台并进行化合物筛选。方法：1)分子水平筛选平台的建立：选用均相时间分辨荧光(HTRF)酪氨酸激酶试剂盒。首先,对ALK和c-Met的酶浓度和酶反应时间进行滴定,选择最佳酶浓度(80%饱和浓度)和线性范围内(R2>0.99)的酶反应时间；然后,使用之前选定的酶浓度和反应时间,对ATP浓度进行滴定,选用1-2倍的Km值作为ATP使用浓度。2)细胞模型的确认：根据文献报道选用H2228和H1993非小细胞肺癌细胞株作为细胞模型,通过Western blot对细胞内的靶点进行确认,利用阳性化合物c-Met/ALK双靶向抑制剂Crizotinib(PF-02341066)确认细胞模型的敏感性。结果：1) ALK-HTRF激酶实验条件：使用0.05ng/μlALK,50μMATP,反应30分钟；c-Met HTRF激酶实验条件：使用0.03ng/μl c-Met,50μM ATP,反应30分钟。共筛选27个化合物,其中有2个化合物(X6,X7)活性较好。2)如文献报道,H2228非小细胞肺癌细胞中表达EML4-ALK融合蛋白,H1993非小细胞肺癌细胞呈c-Met基因扩增,P-Met、Met同时高表达。我们的检测数据表明这两个细胞株是阳性药PF-02341066的敏感株,结果与文献报道一致。结论：1)在分子水平建立了新型ALK、c-Met激酶抑制剂筛选平台-HTRF,可以用来进行化合物筛选。2)确认了非小细胞肺癌细胞株H2228和H1993分别作为EML4-ALK, c-Met依赖性非小细胞肺癌细胞模型,可以用来进行化合物的筛选及相关机制研究。第二部分双靶向ALK和c-Met的小分子抑制剂CM-118的临床前体外药效和药理学研究目的：1)评价CM-118在体外抑制ALK、c-Met激酶的活性和抑制肿瘤细胞增殖的活性;2)确定CM-118对一系列人癌细胞株的选择抑制活性；3)分析CM-118对ALK和c-Met信号通路的靶向抑制及其在非小细胞肺癌细胞生长,存活和迁移中的作用机制；4)初步探索将CM-118与其他抑制剂联合用药的药效及作用机制。方法：1)我们通过HTRF激酶实验测试CM-118在分子水平对ALK和c-Met激酶的抑制活性；2)我们通过细胞增殖实验评估了CM-118对H2228、H1993及其它非小细胞肺癌细胞的抑制活性；3)我们也构建了各种ALK表达载体并将其转染进入HEK-293细胞,以确定CM-118在细胞内对ALK的靶向抑制作用；4)在A549细胞中,我们分析了CM-118对HGF诱导的P-Met的抑制作用；5)通过Western blot,流式细胞术和Transwell迁移实验,我们研究了CM-118对ALK和c-Met的靶向抑制作用以及对肿瘤细胞生长存活和迁移的影响及作用机制；6)我们将CM-118与EGFR抑制剂Afatinib(阿法替尼)或mTOR抑制剂Rapamycin(雷帕霉素)联合使用,观察对肺癌细胞存活的影响。结果：1)CM-118能够有效抑制ALK和c-Met激酶的催化活性,IC50分别为60±10nM和40±5 nM；2)CM-118特异性抑制EML4-ALK依赖性H2228和c-Met依赖性H1993非小细胞肺癌细胞的增殖,ICso分别为1.16±0.43 μM和0.54±0.06μM,明显低于其他非敏感细胞株；3)CM-118能够完全抑制HEK-293中过表达ALK的磷酸化以及A549中HGF诱导c-Met的磷酸化；4)在H2228和H1993非小细胞肺癌细胞中,CM-118通过抑制P-ALK和P-Met进而抑制下游ERK、PI3K/mTOR和Stat3信号通路,引起G1期阻滞,抑制细胞生长存活。CM-118能够显著抑制HGF诱导的细胞迁移；5)联合使用CM-118和EGFR抑制剂Afatinib或mTOR抑制剂Rapamycin,均能叠加或协同性增强细胞凋亡。结论：CM-118是一个双靶向ALK和c-Met致癌基因的高效选择性抑制剂。在非小细胞肺癌疾病模型中,CM-118能够阻断ALK和c-Met介导的肿瘤信号通路,抑制ALK和c-Met依赖性非小细胞肺癌H2228和H1993细胞的增殖。联合使用CM-118和EGFR抑制剂Afatinib或mTOR抑制剂Rapamycin,均能叠加或协同性增强抗肿瘤活性。第三部分ALK信号通路机制研究目的：在HEK-293中表达各种具有致癌活性的ALK蛋白,探讨它们对下游信号通路的影响。方法：我们将全长ALK基因和EML4-ALKv1融合基因转染进入HEK-293细胞,通过Western blot方法检测ALK蛋白的表达及其对下游几个关键信号通路蛋白分子的影响。结果：在HEK-293中过表达全长ALK和EML4-ALKvl融合体均能激活ERK,mTOR和Stat3信号通路。特别是过表达EML4-ALKv1融合体,与全长ALK或点突变ALK F1174L相比,能更加显著的提高Stat3的磷酸化水平。结论：各种ALK癌变基因均能激活下游ERK和mTOR信号通路的级联反应,EML4-ALKv1能够显著提高Stat3的活性,提示其在非小细胞肺癌中发挥重要的致癌作用。