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[目的]: 观察低氧刺激对心肌细胞Notch配体Jagged1表达的影响及机制,分析低氧诱导心肌细胞表达的Jagged1对心脏干细胞分化的影响。 [方法]: 1.采用“机械分散+酶消化”的方法分离出生72h内的新生乳SD大鼠心肌细胞,并用“差速贴壁法”去除混杂的纤维母细胞。 2.基于慢病毒GV218质粒构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)过表达质粒及阴性对照质粒,获得高滴度慢病毒颗粒(HIF-1α-Lent和NC-Lent)。 3.应用HIF-1α-Lent和NC-Lent感染乳大鼠心肌细胞后,72h后荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)表达,应用定量PCR检测Jagged1 mRNA表达。 4.低氧(5%O2、5%CO2、90%N2)培养乳SD大鼠心肌细胞,培养2、4、6、8、12h后采用定量PCR检测Jagged1mRNA表达的变化。 5.应用多种信号通路的抑制剂(PD98059、SP600125、PDTC、DAPT、AG490、Stattic)处理低氧培养的乳鼠心肌细胞8h,Western blotting检测Jagged1蛋白的表达。 6.采用磁性激活细胞分选法(MACS)分选出乳SD大鼠c-KitPOS心脏于细胞(c-KitPOS CSCs),通过免疫荧光、半定量PCR、流式细胞术鉴定其表型。 7.c-KitPOSCSCs以BrdU(20μmol/L)标记后,将乳大鼠心肌细胞与c-KifPOSCSCs直接接触共培养,应用免疫荧光检测其向心肌细胞分化的标志基因NKX2.5的表达情况。 [结果]: 1.成功分离乳SD大鼠心肌细胞,光镜下所见分离的心肌细胞部分呈团蔟状分布,胞浆透亮,细胞群搏动性良好,搏动率约为100次/份;部分心肌细胞呈单层贴壁,细胞形态为柱形,多角形。 2.成功构建HIF-1α-Lent和NC-Lent,其滴度分别为1×108 TU/ml和2.0×109TU/ml。 3.HIF-1α-Lent成功感染乳大鼠心肌细胞并显著上调Jagged1mRNA表达。 4.5% O2氧刺激短时间内(4~6h)下调Jagged1 mRNA的表达,8h后Jagged1mRNA表达上升并处于峰值,12h仍处于高水平。HIF-1α抑制剂YC-1可拮抗低氧对Jagged1的诱导效应。 5.低氧刺激下ERK抑制剂PD98059(50 nmol/L)显著抑制心肌细胞中Jagged1表达,而JAK抑制剂AG490(25μmol/L)和STAT3抑制剂Stattic(10μmol/L)上调Jagged1蛋白的表达;JNK抑制剂SP600125(25μmol/L),Notch抑制剂DAPT(10μmol/L)和NF-κdB抑制剂PDTC(10μmol/L)对Jagged1蛋白的表达影响不明显。 6.成功从乳SD大鼠心脏组织中分离出c-KitPOS CSCs,该细胞NKX2.5弱阳性,但不表达SM22α和vWF; c-KitPOS CSC表达Notch1受体。 7.心肌细胞与c-KitPOS CSCs直接接触培养后能够诱导CSC心肌样分化,间断低氧刺激促进这种分化趋势,而抑制HIF-1α和Notch信号均可减弱低氧条件下细胞共培养所促发的CSC心肌样细胞分化。 [结论]: 1.低氧刺激可能通过ERK信号上调心肌细胞中Notch配体Jagged1的表达,而通过JAK/STAT3信号抑制Jagged1的表达。 2.心肌细胞与c-KitPOS CSCs接触后促进CSC的分化,低氧刺激有助于CSC的分化。 3.DAPT抑制低氧条件下心肌细胞与CSC接触而促发的CSC分化,提示Notch信号在低氧诱导的CSC分化过程中起重要作用。