多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）具有自我更新和分化多潜能性,是生物医学和再生医学研究的理想细胞模型。家畜PSCs,在基因编辑动物生产、加速遗传育种改良、濒危动物保护以及建立医学动物模型方面具有巨大的潜力。扩展多能干细胞（extended PSCs,EPSCs）是利用小分子化合物培养基获得的一种新型多能干细胞,具有胚胎和胚外谱系分化潜能。EPSCs已在人、小鼠、牛、猪等物种上建立,但在绵羊上尚未报道。本研究通过对绵羊成纤维细胞进行重编程,在LCDM（h LIF、CHIR99021、Di M和Mi H）培养体系中建立绵羊EPSCs,并尝试利用体内胚胎ICM建立绵羊胚胎干细胞（sheep embryonic stem cells,sESCs）,同时对获得的EPSCs进行转录组测序和多物种比较分析,探究家畜PSCs建立的分子机制。首先,利用piggy Bac（PB）转座子-牛OSKM重编程因子,对绵羊胎儿成纤维细胞进行电转染,在LCDM培养体系中共建立6株绵羊EPSCs细胞系。绵羊EPSCs具有类似小鼠ESCs的高度致密圆型穹顶集落形态,边界清晰,具有高克隆性和单细胞存活率,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多能性标记基因OCT4、SOX2、KLF4、c MYC、SALL4、和REX1,在免疫荧光检测中表达OCT4、SOX2蛋白,可在体外用酶消化稳定传至40代。在体外既能形成可分化为三胚层细胞的拟胚体,还可以向滋养层方向分化。在NOD-SCID鼠体内能形成含有三胚层细胞的畸胎瘤。表达绿色荧光蛋白的绵羊EPSCs,在小鼠E 3.5胚胎中对胚胎和胚外谱系均有贡献,表现出扩展多能性。其次,鉴于LCDM强大的EPSCs捕获能力,本试验尝试将绵羊植入前体内胚中机械分离得到的ICM进行接种,尝试建立sESCs。sESCs具有类似于hESCs的扁平状克隆形态,可在体外经酶消化传代,稳定传至40代以上,具有较好自我更新的潜能。早期代次细胞表达碱性磷酸酶,以及多能标记基因OCT4、SOX2、KLF4、SALL4、和REX1。在免疫荧光检测中表达OCT4、SOX2、SSEA4蛋白,在体外形成拟胚体并能分化为三胚层细胞,在NOD-SCID鼠体内形成含三胚层细胞的畸胎瘤,但对E 3.5小鼠嵌合胚胎和6.5 D、9.5 D胎儿几乎无嵌合能力。而高代次绵羊ESCs细胞碱性磷酸酶逐渐消失,谱系基因表达上调,多能性逐渐消失。最后,对sEPSCs进行了转录组表达谱分析,与已报道的sESCs、绵羊胚胎、bEPSCs、mEPSCs、hEPSCs进行了多物种比较分析。结果显示,sEPSCs与sESCs、绵羊晚期胚胎基因表达差别明显,三者之间存在完全不同的全局转录谱。另外,sEPSCs与sESCs、绵羊晚期胚胎在DNA甲基转移酶基因、组蛋白甲基化酶基因、组蛋白磷酸化酶基因、组蛋白泛素化酶基因等表观修饰方面基因表达模式也有较大区别。sEPSCs具有与sESCs不同的独特转录组模式,说明sEPSCs可能与Na（?）ve和Primed状态的PSCs处于不同状态。为了找到不同物种间EPSCs的共性,同为LCDM来源的sEPSCs、bEPSCs、mEPSCs和hEPSCs的转录图谱进行了比较。结果显示,sEPSCs与牛、人和小鼠EPSCs有着不同的基因表达模式,但在对绵羊EPSCs中上调基因进行GO富集分析,富集最多的基因是与转录调控区DNA结合调控、细胞骨架、磷酸化酶相关的基因,与人和小鼠EPSCs中的GO富集部分一致。可见,绵羊EPSCs与牛、人和小鼠的转录谱部分相似,但仍具有较强的特异性分子特征。综上所述,LCDM培养体系支持sEPSCs和sESCs的建立,获得的sEPSCs具有独特的转录谱,sESCs更接近Primed多能状态。本研究为家畜动物PSCs的建立开辟了新途径,并为生物学、农业和再生医学等领域的科学研究提供参考。