目的建立大鼠血浆及脑匀浆液中栀子苷含量测定的间接竞争ELISA方法,对该方法进行适用性考察,并且与高效液相法进行对比,为栀子苷浓度分析及药代动力学研究提供新的实验依据。栀子苷是清开灵、醒脑静等抗脑缺血药物的重要有效成分。利用大脑中动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)探讨脑缺血病理过程能否对栀子苷透过血脑屏障产生影响,为栀子苷治疗缺血性中风的应用研究提供更切实际的药代动力学参数。方法1.建立大鼠血浆及脑匀浆液中栀子苷含量测定的间接竞争ELISA方法：制备标准曲线,考察该方法的线性范围、灵敏度、检测限、精密度与准确性、相对回收率、稳定性。同时用HPLC方法对大鼠血浆中栀子苷含量进行测定,并对两种测定方法的检测结果进行比较。2.MCAO大鼠模型的制备：SD大鼠176只,按随机数表法随机分成两组,假手术组和模型组。每组88只,按11个时间点随机分组,每个时间点8只大鼠。造模前全部动物在尾静脉置静脉留置针。MCAO模型造模方法参照文献进行,插线1.5小时后再灌注,记录为计时起点。3.血浆及脑组织样本的取材：模型组和假手术组在计时起点同时经尾静脉注射栀子苷100mg·kg-1,给药后1、5、10、15、20、40、60、90、120、150、180min用真空抗凝管经腹主动脉取血,4000rpm离心10min,取血浆。腹主动脉取完血后用生理盐水灌注10min,取脑匀浆14000r/min,4℃恒温离心10min,取上清。样品处理后,分别采用间接竞争ELISA方法和高效液相法检测血浆样品中栀子苷的浓度,绘制血浆药物浓度-时间表,采用Kinetica version 5.0 (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA)药代动力学软件统计药代动力学参数,以SPSS21.0软件统计参数,数据以X±S表示。②采用间接竞争ELISA方法检测脑匀浆液样品中栀子苷的浓度,用蛋白浓度检测测定试剂盒测定各个标本脑组织匀浆液中蛋白浓度,并且用假手术组平均脑蛋白含量为标准,计算每个蛋白定量后脑中栀子苷含量。栀子苷浓度=检测栀子苷浓度/检测蛋白浓度×标准蛋白浓度。绘制脑组织匀浆液中栀子苷的浓度浓度-时间曲线,以Kinetica version 5.0药代动力学软件非房事模型统计药代动力学参(Cmax、Tmax、T1/2、AUC0-t、MRT),各药代动力学参数的数据以X±S表示。SPSS21.0统计软件处理分析数据。结果1.栀子苷在大鼠血浆中的线性范围为3.125ug/mL-200ug/mL,线性回归方程为y=-0.198 ln(x)+1.206, R2=0.9903。灵敏度(50%抑制时的浓度)为35.36ug/mL。最低检测限为2.59ug/mL,日内精密度和日间精密度的RSD值均小于10%,平均回收率范围为97.93%-111.89%,测栀子苷在大鼠血浆在储存于-80℃冰箱在25天内标准偏差RSD小于5%,室温放置12h标准偏差RSD小于8%,在冻融循环三次标准偏差RSD小于9%。2.栀子苷在大鼠脑匀浆液中的线性范围为3.125ug/mL-200ug/mL,线性回归方程为y=-0.2391n(x)+1.3158, R2=0.9948。灵敏度(50%抑制时的浓度)为为29.73ug/mL。最低检测限为1.81ug/mL,日内精密度和日间精密度的RSD值均小于10%,平均回收率范围为96.53%-110.55%,在储存于-80℃冰箱在25天内标准偏差RSD小于8%,室温放置12h标准偏差RSD小于6.5%,在冻融循环三次标准偏差RSD小于7.8%。3.高效液相法中,以栀子苷峰面积(Y)对栀子苷浓度(x)作线性回归。栀子苷标准曲线回归方程为y=0.0554x-0.7462 (R2=0.9989)。结果表明血浆浓度在1～100ug/mL范围内线性好,最低定量限为2ug/mL, RSD为7.53%。日内精密度小于5%和标准偏差RSD日间精密均小于6.5%,平均回收率范围为97.39%-107.30%,在储存于-80℃冰箱在25天内标准偏差RSD小于8.2%,室温放置12h标准偏差RSD小于3.6%,在冻融循环三次标准偏差RSD小于7.6%。4.从用ELISA测得模型组和假手术组大鼠血浆中栀子苷浓度-时间曲线表明,模型组的Cmax=1530.87±298.22ug/mL, Tmax=4.25±3.95min, AUC0-t=46583.75± 11767.14ug/mL·min, T1/2=53.91±18.84min, MRT=76.65±13.21min;假手术组：Cmax=1294.45±371.08ug/mL, Tmax=5.5±5.50min, AUC0-t=45066.25±14540.23ug/mL·min, T1/2=46.31±16.05min, MRT=77.51±16.11min。两组数据经计算没有统计学差异。5.间接竞争ELISA法研究MCAO模型对大鼠栀子苷影响的血药浓度时间表,用SPSS21.0统计软件统计分析,t=15min栀子苷浓度模型组大于假手术组,p=0.03;t=20min:模型组小于假手术组,p=0.02；其余时间点没有差异,表明在t=15-20min过程中栀子苷的血药浓度减少较快,分析原因可能的与MCAO模型促进栀子苷进入脑有关。6.从用HPLC测得模型组和假手术组大鼠血浆中栀子苷浓度-时间表明：模型组的Cmax=1419.625± 414.96ug/mL, Tmax=37.45±9.33min, AUC0-t=25412.99± 3718.59ug/m·min,T1/2=26.61±6.44min,MRT=76.65±13.21min;假手术组：Cmax =1067.88±98.35ug/mL,Tmax=1.5±1.414min,AUC0-t=24120.26±6859.672ug/mL·min, T1/2=23.07±9.08min,MRT=48.467±12.17min。两组数据经计算没有统计学差异。7.高效液相法研究MCAO模型对大鼠栀子苷的药代动力学研究,用SPSS21.0统计软件统计,t=15min栀子苷浓度模型组大于假手术组,p.0.002;t=20min:模型组小于假手术组,p=0.007；t=40min栀子苷浓度模型组大于假手术组,p=0.02；其余时间点没有差异。血液中栀子苷药时曲线会出现双峰,第二次达峰时间更快。模型组栀子苷代谢快,可能与MCAO模型促进栀子苷进入脑有关。8.ELISA法和高效液相法所测出模型组大鼠血浆的药时曲线和报道趋势一致,发现了栀子苷的血液浓度-时间曲线均出现双峰现象。model组t=15min ELISA法和HPLC检测有显著差异p=0.003;在t=20min ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.01；在t:40min ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.008；在t=60min ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.04;t=180min ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.005；其余则ELISA法和HPLC检测没有显著差异。ELISA法和HPLC检测结果大体一致。Sham组t=40,ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.02;t=60,ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.01;t=90,ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.03;t=150,ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.02;t=180,ELISA法和HPLC检测有显著差异,p=0.007,其余则ELISA法和HPLC检测没有显著差异。我们分析可能的原因是,两种方法的最低检测限不同造成的。9.栀子苷浓度-时间表和曲线。从药时曲线看出栀子苷从血液进入大脑有双峰现象,第一个峰应该是在15min左右,第二个峰在60min左右。用SPSS21.0统计软件处理分析数据在t=10,60,时模型组左侧和假手术组有明显差异,p<0.05；t=40,60时模型组右侧和假手术组有明显差异,p<0.05；t=1,5,10,40,60,90时模型组左侧和右侧有明显差异p<0.05。模型组左侧Cmax=379.45±112.91ug/mL,Tmax=41±40min,AUC0-t=36932.5±3607.51ug/mL·min,T1/2=66±31,MRT=125±33min。模型组右侧Cnax=420.25±79.03ug/mL,Tmax=43±33min,AUC0-t=44606.88±7209.59ug/mL·min, T1/2=84±56,MRT=141±74min.假手术组Cmx=391.21±50.17ug/mL,Tmax=33±27min, AUC0-t=36407.16±5765.45ug/ml·min,T1,2=135±122,MRT=194±151min.经统计分析,Mode right AUC0-t>Mode left AUC0-t,P=0.009；Mode right AUC0-t>Sham AUCo-t,P=0.012434；Mode left AUC0-t和Sham AUC0-t,P=0.4.脑中栀子苷的浓度：模型组右侧(栓塞侧)>模型组左侧,P=0.009；模型组右侧(栓塞侧)>假手术组,P=0.012模型组左侧和假手术组差异没有显著性,P=0.4。结论1.基于酶联免疫吸附法检测快速、高效、高灵敏度和高特异性的优点,本实验对酶联免疫法所检测的生物样品中栀子苷含量进行了方法学考察。实验结果表明,基于酶联免疫吸附法所绘制的标准曲线线性范围良好,灵敏度高,精密度、准确性与相对回收率均符合生物样品的检测范围标准。2.本实验用间接竞争ELISA法和高效液相法同时研究MCAO模型对大鼠血浆栀子苷的药代动力学。对比ELISA法和高效液相法检测得数据,二者药时曲线趋势一致。3.MCA0大鼠模型组和假手术组的血浆中栀子苷药时曲线趋势和既往报道一致。栀子苷的血药浓度-时间曲线出现双峰现象。0-10min模型组栀子苷血药浓度比假手术组栀子苷血药浓度高。在15-20min过程中模型组栀子苷血药浓度比假手术组栀子苷血药浓度下降速度较快。模型组栀子苷血药浓度比假手术组栀子苷血药浓度第二次达峰时间快,但第二达峰值较低一些。4.MCAO大鼠模型组左侧、模型组右侧和假手术组脑内栀子苷含量：模型组右侧(栓塞侧)>模型组左侧,模型组右侧(栓塞侧)>假手术组。再灌注损伤后,脑组织对栀子苷的吸收增加,表明脑缺血后栀子苷进入脑组织的速度增快,这可能与脑缺血后血脑屏障破坏有关。5.与传统采用正常动物相比,用大鼠MCAO模型研究抗脑缺血药物的药代动力学,得出的药物在血和脑中的药代特征可能不一致,说明疾病状态尤其是血脑屏障的破坏,会对药物的药代动力学参数产生影响。因此,在抗脑缺血药物的研究中,采用脑缺血模型动物观察药代动力学,更符合临床实际,对临床实践更有指导意义。