鸡肉肽参与美拉德反应的机理及其反应产物风味特性研究

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本文主要研究了鸡肉肽参与美拉德反应的特点、机理及其美拉德反应产物(MRPs)的风味特性。以鸡胸肉为原料,对木瓜蛋白酶PSM 500、风味蛋白酶Flavourzyme、碱性蛋白酶Alcalase、复合蛋白酶Protamex酶解鸡肉的条件进行优化。以水解度和肽分布为指标,通过优化,发现Protamex与Flavourzyme结合水解鸡肉的200-5000Da肽含量最多,水解度适中。采用同时添加的方式酶解4h,此条件下酶解鸡肉的水解度可达12.8%,且酶解产物风味良好。将鸡肉酶解物除脂,过5000Da超滤冻干获得鸡肉肽。通过反应模型的构建,发现鸡肉肽主要通过贡献吡嗪类物质尤其是2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3,5-二甲基-2-乙基吡嗪而引起的产物的烤/坚果香、甜香强度的增加,这种香气通常被形容为一种“基础肉香”或“增强肉香”。通过与鸡肉肽-木糖-Cys及木糖-Cys反应产物对比得知,Cys的添加会引起体系含硫挥发性化合物的增加,而对吡嗪的生成具有抑制作用。Cys可以通过这种调节作用增强体系肉香,降低烤/焦香气。而鸡肉肽的添加对Cys-木糖体系具有复杂的作用,一方面导致具有煮肉香气的2-甲基-3-呋喃硫醇、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚、2-甲基-3-甲硫基呋喃含量减少,另一方面还促进了体系中吡嗪类、噻唑类、噻吩类的生成。同时,具有烤咖啡、刺激气息的糠硫醇的含量也明显减少。这些变化共同引起了反应产物具有了更柔和的肉香。对不同加热条件下的鸡肉肽美拉德反应产物的风味、挥发性物质,不挥发性物质进行测定。结果显示,鸡肉肽-美拉德反应产物的鲜味和醇厚滋味需要较低的反应温度(80-110℃),而烤/坚果、甜香韵的大量产生需要较高的温度(110-120℃),过高的温度(>120℃)会导致明显焦糊味和苦味的产生。对反应产物的氨基酸分析表明,鸡肉肽在加热过程中会释放大量的鲜味氨基酸,引起反应产物鲜味的增强。而所有反应产物中的Cys含量都非常低,导致产物中无大量含硫化合物的生成,这是鸡肉肽氨基酸组成的突出特点。对肽分布的分析表明,鸡肉肽在反应初期会伴随着大量的1000-3000Da肽断裂为500-1000Da肽段,200-500Da肽段断裂为<200Da肽段,而200-500Da肽段有可能是最终参与到美拉德反应中的肽段。而在反应后期,鸡肉肽有可能会发生交联现象。利用超滤、凝胶色谱、高效液相色谱对鸡肉肽中具有美拉德反应活性的肽进行分离纯化。结果发现,鸡肉肽>5000Da肽段的美拉德反应活性最低。而<1000Da肽段的反应活性最强,主要通过贡献吡嗪类物质对反应产物的烤/坚果香气具有贡献。随后利用Q-TOF MS/MS技术对目标肽进行了纯化和鉴定,最终鉴定出了42条主要的肽。鉴定结果表明,鸡肉酶解产物中含有大量的Leu(Ile)-X-、Ala-X-和pGlu-X-结构的肽。其中,N端为Leu的短肽在美拉德反应中具有较高的反应活性。而N端为pGlu的肽对反应产物的鲜味具有重要的作用。本研究还发现,肽段N端的氨基酸对肽段的性质和反应活性具有重要的影响。以纯肽为研究对象,对模型美拉德反应体系进行构建。利用GC-MS、LC-MS及13C5木糖同位素示踪法对肽参与美拉德反应的途径进行了深入的研究。结果显示,肽美拉德反应体系中生成吡嗪的碳骨架全部由木糖提供,并且主要通过氨基酮途径缩合生成。而含有Cys的美拉德反应体系中以木糖C5单位的含硫化合物的生成有三个途径:糠醛路径,主要产物是糠硫醇;2-甲基-3-糠醇路径,主要产物为2-甲基-3-呋喃硫醇及其二聚物;2-甲基呋喃路径,主要产物为2-甲基噻吩、2-甲基-5-甲硫基噻吩。而噻吩硫醇是由半胱氨酸降解产物巯基乙醛与木糖的C2单位的共同产物,同位素分布比例又说明巯基乙醛缩合是主要途径。噻吩和3-甲硫基噻吩分别为噻吩硫醇进一步的反应产物。而噻吩的[M+4]离子的比例较高,说明其还有其它生成途径。对于3-噻吩甲醛、5-甲基-2-噻吩甲醛和3-甲基-2-噻吩甲醛,本实验发现其同为素分布仅为[M+3]与[M+5]或[M+2]与[M+4],其它同位素峰未检测出,推断这三种物质为巯基乙醛与木糖C3或C4单位结合生成。非挥发物产物中,肽可以单纯通过热降解发生断裂和环化反应,断裂和环化是肽在美拉反应中一个普遍的现象。肽可以与糖生成Amadori产物,后续有两条不同的路径,其中一条路径可断裂糖形成肽-C2/C3/C4席夫碱类产物,进一步生成氨基酮类化合物,形成吡嗪。另一条是肽类可以与以糠醛进行交联。形成的交联产物会影响后续以糠醛为基础的含硫化合物的形成。
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