研究背景博来霉素是一种抗癌类抗生素药,属于碱性糖肽类药物,它的主要功能是抑制胸腺嘧啶核苷,防止胸腺嘧啶核苷参入DNA,与DNA结合,从而使DNA分解破坏。在增殖细胞的细胞周期的S期起着很重要的作用。早在1966年已被成功地用于治疗各种肿瘤,包括肺癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、头颈部及皮肤鳞状癌。博来霉素的不良反应主要是引起间质性肺炎,肺纤维化(也称为纤维性肺泡炎),致病可能性高达10%。吉非替尼,是一种常见的选择性的表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂,主要适用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC),或那些在此之前接受了化学治疗且并不适合化疗的病人。通常也能接受转化生长因子和表皮生长因子,刺激成纤维细胞增殖,这一过程在肺纤维化的发病机制中起着重要作用。然而,研究表明,表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKI)可以抑制表皮生长因子增殖,从而可以防止肺纤维化的形成。研究目的1.观察吉非替尼对博来霉素导致的小鼠肺损伤的影响。2.通过研究博来霉素与吉非替尼的联合用药方案,观察联合用药对HUVECs细胞生长的影响。研究方法1.体内实验首先,构建由博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型,用以研究吉非替尼对小鼠肺纤维化的影响。将C57BL/6小鼠分为3组：分别为控制组,博来霉素组,吉非替尼+博来霉素组。控制组给予气管注射生理盐水,博来霉素组和吉非替尼+博来霉素组给予气管注射博来霉素,之后3周,分别用吉非替尼和盐水给吉非替尼+博来霉素组和博来霉素组灌胃(100mg/kg体重)。3周后,处死小鼠,收集小鼠的肺组织,并研究发病机理。在整个研究期间,每天测量小鼠体重并观察小鼠的身体情况。小鼠的肺组织取出来后,一半固定在10%的甲醛中,留做HE染色；另外一半肺组织保存在空管中,用于提取RNA和蛋白质,将RNA反转录为cDNA,并通过PCR和Western blotting的方法发现在炎性蛋白质的差异。通过检测MPO含量,检测是否存在中性粒细胞及其含量,从而检测炎性因子的活性。2.体外实验体外试验包括细胞培养、细胞分组、细胞处理、细胞间培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。分别用博来霉素、吉非替尼、博来霉素+吉非替尼三种方式刺激培养细胞。将培养的细胞分为四组：正常对照组(A)、博来霉素组(B)、吉非替尼组(C)、博来霉素+吉非替尼组(D)。分别用以下检测方法进行检测：(1)MTT细胞增殖实验检测博来霉素和吉非替尼对细胞的影响；(2)细胞染色实验,细胞迁移实验检测吉非替尼和博来霉素对细胞的毒性影响；(3) RT-PCR的实验方法来检测博来霉素和吉非替尼对HUVECs细胞的一些炎性细胞因子的影响；(4) Western blotting的实验方法来检测博来霉素、吉非替尼、博来霉素+吉非替尼对HUVECs的NF-κB和细胞粘附分子(VCAM-1)的二种蛋白水平影响。实验结果1.体内实验结果小鼠经过21天的药物诱导之后处死,解剖获得小鼠的肺组织,小鼠解剖全程留拍照片,观察小鼠肺部炎症图片,从而看出博来霉素组小鼠比吉非替尼+博来霉素组小鼠炎症更明显,博来霉素组小鼠可以通过吉非替尼的治疗减轻或阻止肺部伤害。病理组织学结果表明,由博来霉素成功诱导的肺纤维化的小鼠,可通过吉非替尼抑制成纤维细胞的增殖。吉非替尼+博来霉素组的小鼠存活率远超过博来霉素组小鼠。结果还表明,吉非替尼+博来霉素组小鼠的体重明显高于博来霉素组小鼠。吉非替尼+博来霉素组小鼠的体重增长几乎与控制组小鼠的体重增长相当。RT-PCR结果表明,博来霉素组小鼠炎症标记物TNF-α,IL-1β和IFNγ明显高于吉非替尼+博来霉素组。博来霉素组与控制组相比,TNF-α,IL-1β和IFNγ的mRNA的表达水平更高,而吉非替尼组,这些炎症标记物的表达水平明显减少。Western blotting结果表明,博来霉素组小鼠的NF-κB的蛋白和细胞粘附分子(VCAM-1)表达水平明显高于控制组和吉非替尼组。且对照组小鼠的蛋白表达水平低于吉非替尼组。2.体外实验的结果MTT方法检测吉非替尼、博来霉素对人脐静脉内皮细胞的增殖和毒性作用：(1)细胞增殖作用：博来霉素组值高于正常对照组组(P<0.05),博来霉素组OD值显著高于博来霉素+吉非替尼组(P<0.05)。 (2)细胞毒性作用,检测结果显示各组差异并不明显。而细胞抑制实验结果显示,博来霉素对HUVECs细胞增殖有显著的抑制作用,而博来霉素+吉非替尼对HUVECs的细胞抑制效果并不明显,其细胞毒性和凋亡方面也没有显著影响(P>0.05)。RT-PCR的检测结果：(1)HUVECs细胞炎性因子mRNA水平博来霉素组与正常对照组相比,博来霉素组的细胞炎性因子如白细胞介素-6、CXCL-2、白细胞介素-8、MCP-1.的mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.05)。(2)博来霉素+吉非替尼组细胞的炎性因子白细胞介素-6、CXCL-2、白细胞介素-8的mRNA水平明显低于博来霉素组(P<0.05)。(3)MCP-1的mRNA水平吉非替尼组显著高于正常对照组(P<0.05),博来霉素+吉非替尼组显著高于博来霉素组(P<0.05)。以上结果表明在博来霉素刺激下,吉非替尼能够有效的抑制人脐静脉内皮细胞炎性细胞因子(MCP-1除外)的分泌。Western blotting方法检测博来霉素和吉非替尼对人脐静脉内皮细胞的蛋白的表达情况结果如下：(1)正常对照组和吉非替尼组相比,人脐静脉内皮细胞的NF-κ B和VCAM-1的蛋白表达量明显增高(P<0.05)。(2)博来霉素组和博来霉素+吉非替尼组相比,人脐静脉内皮细胞的NF-κB、VCAM-1表达量也明显上升(P<0.05),以上结果表明博来霉素可以使人脐静脉内皮细胞的NF-κB、VCAM-1蛋白的表达出现明显的上调作用,但此作用可以被吉非替尼抑制。结论体内实验结果表明,在小鼠体内,吉非替尼可以减弱博来霉素诱导的肺纤维化,并通过表皮生长因子的受体酪氨酸激酶抑制剂的作用,选择性地抑制信号传导通路而发挥作用,即抑制间质细胞的增殖以防止肺纤维化。因此可以推断,人肺纤维化治疗过程中,抑制靶向酪氨酸激酶受体的作用可能是关键所在。体外实验表明,通过检测博来霉素和吉非替尼对HUVECs细胞的增殖和毒性的影响以及多种细胞因子、细胞通路蛋白(NF-κB)、细胞黏附分子(VCAM-1)等的表达情况,可以确定吉非替尼可以对博来霉素诱导的人脐静脉内皮细胞的细胞增殖和多种细胞因子的分泌都有很强的抑制作用。