在过去的十年中,养猪行业中猪链球菌感染被认为是世界范围内猪呼吸道疾病主要的病原菌之一。猪链球菌的天然宿主是猪的上呼吸道、扁桃体、鼻腔,能引起脑膜炎、肺炎、关节炎等症状,不仅可以感染动物,还可以感染人。由于在治疗猪链球菌感染的首选药物青霉素的耐药问题越来越严重,现在越来越多的大环内酯类药物被用于医学和兽医临床。乙酰吉他霉素是一种16元环大环内酯类药物,还没有在兽医临床上广泛应用。目前由于兽医临床上药物滥用乱用现象严重,不能达到最佳的给药效果,治疗失败的同时导致耐药性的产生。为了避免或者尽量减少此种现象的发生,PK-PD模型将被引入到给药方案的制定中。PK-PD模型能反映宿主机体、病原微生物、药物三者之间的相互关系,从而来制定合理的给药方案。本课题拟将通过研究乙酰吉他霉素对猪链球菌的体外药效学(in-vitro PD)、间接体内药效学(ex-vivoPD),通过电子支纤维镜直接在肺部进行采样,建立半体内模型,研究肺部药动学,将体内肺部药动学和半体内药效学结合起来,并通过软件模拟验证给药剂量。1.乙酰吉他霉素对猪链球菌的药效学试验参考美国临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的相关标准文件,采用微量肉汤稀释法,测定乙酰吉他霉素及分离出来的5个主要单组分在肉汤和肺泡液中对临床分离的猪链球菌1607(2型)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明乙酰吉他霉素及5个主要的单组份A6A7、A5’、A4A5、A1A3、A13对1607(2型)MIC均为1μg/mL,MBC均为2μg/mL,说明在乙酰吉他霉素在肉汤和肺泡液中有相同的抗菌活性,差异性不大;同时测定乙酰吉他霉素的主要代谢产物吉他霉素A7、A6、A5、A4、A1、A3、A13七个组分,对猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为2 μg/mL,8 μg/mL;通过平板涂布方法测得乙酰吉他霉素对猪链球菌的最小防耐药突变浓度MPC为5μg/mL;将猪链球菌1607(2型)暴露在不同浓度的乙酰吉他霉素1h、2 h后,测定猪链球菌与不同浓度的乙酰吉他霉素接触1h、2 h后的抗菌后效应,猪链球菌与2 MIC和4 MIC暴露1h的抗菌后效应是1.59 h、1.88 h,猪链球菌与2 MIC和4 MIC暴露两个小时的抗菌后效应是2.33 h、2.96 h,说明乙酰吉他霉素对猪链球菌有较长的抗菌后效应;根据测定的MIC结果,设置不同浓度的乙酰吉他霉素药物浓度(0 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC、16 MIC、32 MIC、64 MIC)绘制对猪链球菌的体外抑菌曲线,通过抑菌曲线可以看出乙酰吉他霉素的杀菌特点表现为较长PAE的时间依赖性,随着时间的增加,抗菌作用效果逐渐增强,同时随着药物浓度的增加,抑菌作用效果逐渐增强,也表现为一定的浓度依赖性;将不同时间点采集的肺泡液,离心过滤后,与细菌孵育,绘制半体内的杀菌曲线,与体外的杀菌曲线相似,都表现为较长PAE的时间依赖型,和一定的浓度依赖性。在健康猪的半体内杀菌曲线中可以看出在1h、2 h、4 h、6 h、8h有较强的抗菌活性,随着时间的延长抗菌活性增强,在患病猪的半体内杀菌曲线可以看出有相似的杀菌效果,在12h时也有一定的杀菌活性,其他相似。结合半体内的药效学和体外的药效学数据,和查阅的相关文献,确定描述乙酰吉他霉素对猪链球菌作用特点的PK-PD参数为AUC/MIC。2.乙酰吉他霉素及其单组份在猪体内的药动学研究试验选用12头20 kg左右的断奶仔猪,随机分为两组,分别为健康组和患病组,每组六只,采用皮下注射的方法构建患病模型,同时建立健康模型作为对照试验组。两组动物按50 mg/kgb.w.灌胃给药后,通过猪的前腔静脉在0.25 h、0.5 h、0.75 h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采血,样品处理后经 LC-MS/MS 检测不同时间点的药物浓度,结果显示血浆中乙酰吉他霉素的各个时间点浓度较低,且浓度在MIC以下,不能表现出细菌与药物之间的相互作用;通过电子支纤维镜在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h进行采样,样品处理后经LC-MS/MS检测,经过Winnonlin药动学软件对其进行拟合,乙酰吉他霉素及其单组分在患病和健康模型中均符合一级吸收二室模型。单组分乙酰A6A7在肺部的达峰时间Tmax为4.38-4.54 h、达峰浓度Cmax为1.68-1.71 μg/mL、消除半衰期T1/210为5.24-8.19 h、药时曲线下面积AUC为9.59-20.55 h·μg/mL;乙酰A5’在肺部的达峰时间Tmax为3.80-4.01 h、达峰浓度Cmax为3.34-3.47μg/mL、消除半衰期T1/210 为 6.57-6.70 h、药时曲线下面积 AUC 为 79.56-80.39 h·μg/mL;乙酰 A4A5 在肺部的达峰时间Tmax为3.91-4.40 h、达峰浓度Cmax为3.56-3.68μg/mL、消除半衰期T1/210 为 8.35-9.41 h、药时曲线下面积 AUC 为 112.02-118.41 h.μg/mL;乙酰 A1A3 在肺部的达峰时间Tmax为3.91-4.72 h、达峰浓度Cmax为0.98-1.02μg/mL、消除半衰期T1/210为4.93-5.04 h、药时曲线下面积AUC为19.24-19.96 h·μg/mL;乙酰A13在肺部的达峰时间Tmax为3.74-4.21 h、达峰浓度Cmax为0.81-0.82 μg/mL、消除半衰期T1/210为5.97～6.67 h、药时曲线下面积AUC为16.88-18.88 hμg/mL;乙酰吉他霉素总组份在肺部的达峰时间Tmax为4.26-4.44 h、达峰浓度Cmax为2.79-2.81 μg/mL,消除半衰期 T1/210 为 6.12-6.43 h,药时曲线下面积 AUC 为 61.78-63.46 h·μg/mL。3.半体内PK-PD模型的拟合与给药方案制定通过体外和半体内杀菌曲线确定了描述乙酰吉他霉素杀菌作用特点的PK-PD参数为半体内AUC/MIC。再通过Sigmoid Emax方程模拟半体内AUC/MIC值与肺部不同药物浓度和猪链球菌的数目减少之间的关系,患病猪的半体内PK-PD方程为:E = 3.28-7.58×C2.01/19.812.01+C2.01,当E=0、-3、-4(抑菌、杀菌、根除)时,求出对应的C值,即半体内AUC/MIC(h)值分别为17.31、43.37、96.81。结合给药方程Dose = CL ×AUC/MIC/FU×F×MIC与临床分离目标菌株的MIC值,可得不同条件下的给药剂量Dose(mg/kg/d)。当临床分离猪链球菌的MIC50为1μg/mL,AUC/MIC(h)值分别为17.31、43.37、96.81时,对应乙酰吉他霉素的给药剂量为15.62 mg/kg/d、39.14 mg/kg/d、87.36mg/kg/d(抑菌、杀菌、根除)。在体外杀菌曲线和半体杀菌曲线的结果中可以看到,在给药后1 h采的样,随着时间的延长浓度高于2 MIC时乙酰吉他霉素抑菌作用明显,2 h～12 h随着浓度的增加,抑菌作用也明显增加,在2 MIC浓度以下的猪链球菌恢复生长较快。结合T>M1C(16.7 h)、T>MPc(10.13 h)和抗菌后效应PAE=2.96 h,并通过软件MlxPlore模拟在确定的给药剂量下的给药时间间隔。若是每天给药一次,大部分时间药物浓度在1 MIC左右,在所测得的耐药突变窗范围之内,容易引起细菌产生耐药性,导致治疗失败,同时通过耐药风险评估可以看出在12 h之后容易出现耐药菌株;若是浓度在耐药突变窗(5μg/mL)以上就会避免这种情况。因此,综合考虑乙酰吉他霉素的抗菌后效应,缩短给药时间间隔,每天给药两次,药物浓度在12h内就会在耐药突变窗以上,理论上不会产生耐药猪链球菌。根据测得耐药风险评估结果,也不推荐每天一次给药。按治疗剂量每天给药两次可避免耐药细菌的产生。所以,对于猪链球菌引起的呼吸道疾病病的预防给药方案为15.62 mg/kg;治疗给药方案为39.14 mg/kg;根除方案为87.36 mg/kg。考虑到现现代化的养殖方式,口服给药繁琐,根据群体给药公式D=d×n/W,n表示每天给要得次数,d表示按体重给药量,W为不同年龄段猪体重与采食量的转化比,20 kg左右的猪的W值约为50 g/kg/d,D为群体混饲给药量,由此而计算得到混饲给药量是1.56 g/kg饲喂给药,每天两次。4.模型验证选用MIC值为1 μg/mL的临床分离猪链球菌1607对仔猪进行攻毒,根据PK-PD模型制定的防耐药给药方案:39.14 mg/kg每天两次口服给药治疗,结果表明该给药方案对发病的仔猪保护率达到66.7%且减少了耐药猪链球菌的产生。综上所述,本课题中阐述了乙酰吉他霉素对猪链球菌的抗菌作用特点,描述了乙酰吉他霉素在健康仔猪和患病仔猪体内的药动学特征,通过电子支显微镜对肺部进行采样建立半体内PK-PD模型的研究,确定了乙酰吉他霉素对猪链球菌的给药治疗方案,很好的防止了猪链球菌耐药的产生,为临床合理使用乙酰吉他霉素提供了科学依据。