研究背景:恶性肿瘤是威胁人类健康的一大类疾病,转移是肿瘤主要恶性生物学特征之一,约90%的癌症患者死亡是由肿瘤转移引起,血行转移是肿瘤发生远处转移的主要途径。近年来,肿瘤干细胞(cancer stem like cells,CSLCs)以其自我更新、抗凋亡、增殖分化、侵袭、耐药等恶性生物学特性被认为是决定肿瘤复发、转移的关键。研究发现血液循环中的肿瘤细胞能够检测到干细胞表型,因此肿瘤干细胞可能是介导肿瘤血行转移的关键。肿瘤细胞在血液循环中与转移靶器官血管内皮细胞粘附、外渗是血行转移过程的关键步骤之一,有研究表明血液循环中的中性粒细胞(Polymorphonuclear leukocytes,PMNs)及高凝状态能够促进肿瘤细胞与血管内皮的粘附、外渗作用,本研究以肿瘤干细胞与血管内皮细胞粘附、外渗的生物学行为为研究切入点,从CSLCs与肿瘤细胞招募PMNs,血管内皮粘附,血管外渗及靶器官种植角度探讨扶正祛毒方防治肿瘤血行转移的机制。探索乳腺癌干细胞在介导血行转移中的作用、机制及中药扶正祛毒方的干预作用和分子机制,为中医药靶向调控肿瘤干细胞防治肿瘤转移提供新的科学依据。研究方法:以Tumor Spheres Formation法在4T1乳腺癌细胞系的基础上分离、富集乳腺癌干细胞,并建立稳定的乳腺癌干细胞、4T1乳腺癌细胞与PMNs共培养体系。用平行板流动小室建立平行板流动实验体系,体外模拟肿瘤患者血液高凝状态,比较乳腺癌干细胞与4T1乳腺癌细胞在流动体系中的PMNs介导下,发生血管内皮粘附、外渗的水平以及中药扶正祛毒方的干预作用。通过ELISA检测实验体系中细胞上清IL-8分泌水平;流式检测乳腺癌干细胞、4T1乳腺癌细胞膜表面粘附分子ICAM-1、αvβ3及PMNs表面β2整合素表达水平,明确乳腺癌干细胞在流动体系中的PMNs介导下,发生血管内皮粘附、外渗的作用机制及扶正祛毒方的干预作用机制。通过Transwell迁移实验体系比较PMNs对乳腺癌干细胞、4T1乳腺癌细胞迁移作用的影响,并检测t-PA纤溶系统相关分子的mRNA表达水平,探索其作用机制。通过对BALB/c小鼠尾静脉接种4T1乳腺癌细胞模拟乳腺癌血行转移过程,建立尾静脉接种肺转移体内实验模型,研究扶正祛毒方防治肿瘤血行转移的作用及机制。通过体内实验进一步验证扶正祛毒方调控乳腺癌干细胞血行转移的作用及机制。研究结果:(1)CSLCs在模拟高凝流动体系中PMNs作用下具有较4T1细胞更强的血管粘附、外渗能力(粘附作用:843.0±1.16vs152.0±2.31个/视野,P<0.01;外渗作用:666.3±8.65 vs 627.0±8.39 个/视野,P<0.05)。(2)CSLCs在模拟高凝流动体系中PMNs作用下的高血管粘附、外渗能力可能与CSLCs膜表面高表达粘附分子ICAM-1(80.25%±4.45%vs 55.35%±5.81%,P<0.05)、αvβ3(15.28%±0.85%vs0.54%±0.11%,P<0.01),同时分泌更高水平的 IL-8(78.72±4.24pg/mlvs9.705±0.47pg/ml,P<0.01)有关。(3)PMNs能够促进4T1细胞的迁移作用(174±7.239vs 284.8±8.139个,P<0.0001),其机制可能与激活t-PA纤溶系统,促进t-PA相关分解酶类的表达水平(P<0.01)有关。(4)CSLCs在Fn模拟的高凝状态下,PMNs介导的血管粘附、外渗能力增强(574.3±8.09 vs 666.3±8.65 个/视野,P<0.01);迁移作用也有所提高(137±15.37 vs218.6±9.158 个/视野,P<0.05)。(5)CSLCs较4T1细胞更强的t-PA纤溶系统激活能力(P<0.01),可能具有更强的t-PA系统介导的相关效应。(6)扶正祛毒方对于CSLCs、4T1细胞在高凝流动体系中PMNs介导的血管内皮粘附、外渗过程有一定的抑制作用(粘附作用:对照组843.0±1.16个/视野vs中剂量38.33±2.03个/视野,高剂量9.333±1.46个/视野,P<O.O1;外渗作用:对照组 666.3±8.65 个/视野 vs 中剂量 500.3±8.83,高剂量 402.7±22.98 个/视野,P<0.01)。(7)扶正祛毒方抑制CSLCs、4T1细胞在高凝流动体系中PMNs介导的血管内皮粘附、外渗作用可能是通过抑制IL-8分泌(平行板流体实验:对照组84.43±3.21pg/mlvs 中剂量组 47.95±4.750pg/ml，高剂量组 63.69±1.563pg/ml,P<0.01;流动迁徙实验:78.72±4.24pg/mlvs23.93±3.45pg/ml,67.53±2.37pg/ml,P<0.01),降低PMNs膜表面β 2整合素表达(对照组26.59±1.52%vs中剂量组21.20±0.63%,高剂量组18.78±0.49%),抑制4T1细胞、CSLCs与PMNs粘附、外渗有关。(8)扶正祛毒方能够抑制4T1细胞、CSLCs的迁移作用(4T1:对照组284.8±8.14 个 vs 中剂量组 282.6±8.01 个,高剂量组 112.8±6.95 个,P<0.01;CSLCs:对照组218.6±9.158个vs中剂量组116.6±7.075个,高剂量组66.40±8.334个,P<0.01),其机制可能与上调肿瘤细胞间粘附分子表达(对照组18.42±0.18%vs高剂量组 33.42±0.29%,P<0.01),上调抑癌性分子 PAI-1(4T1:对照组 0.99±0.02 vs中剂量组1.09±0.04,高剂量组3.37±0.22;CSLCs对照组1.69±0.03vs高剂量组 2.61±0.10，P0.01)TFPI(4T1:对照组2.67±0.02 vs 高剂量组 3.83±0.15;CSLCs:对照组2.90±0.09vs中剂量组3.97±0.13,P<0.01)表达水平有关。(9)提前7天灌喂扶正祛毒方能够显著抑制尾静脉接种肺转移模型小鼠的肺转移结节数目(模型组81.2±13.7个vs中药中剂量17.4±4.6个,中药高剂量13.8士2.1 个,P<0.01)。(10)扶正祛毒方对于尾静脉接种肺转移模型小鼠血行转移的抑制作用可能与抑制小鼠外周血液循环中IL-8水平(31.54±0.68pg/ml vs29.05±0.48pg/ml,P<0.05),下调小鼠外周血PMNs整合素β2的表达水平(模型组24120±1441 vs中药高剂量 16060±1511,P<0.05)有关。(11)扶正祛毒方对于尾静脉接种肺转移模型小鼠血行转移的抑制作用可能与上调肿瘤组织细胞表面粘附分子ICAM-1(模型组37.50±4.89%vs中药中剂量74.67±7.22%.P<0.01)、αvβ3(模型组 80.25%±4.45%vs 中药高剂量 55.35%±5.81%，P<0.01)的表达水平,增强肿瘤细胞间的粘附作用,稳定瘤体有关。结论:①CSLCs在模拟高凝流动体系中PMNs作用下具有较4T1细胞更强的血管粘附、外渗能力的生物学特性;CSLCs的这种生物学特性可能与CSLCs膜表面表达更高水平的粘附分子ICAM-1、αvβ3,同时自分泌较高水平IL-8有关;②PMNs能够促进共培养体系中4T1细胞、CSLCs迁移,其作用机制可能与t-PA系统的激活有关;③扶正祛毒方能够显著抑制CSLCs在高凝流动体系中PMNs介导的血管内皮粘附、外渗作用。这种作用可能与扶正祛毒方抑制CSLCs自分泌IL-8,下调PMNs胞膜表面β2整合素表达水平有关。④扶正祛毒方能够显著抑制4T1细胞及CSLCs的迁移作用。其作用机制可能与扶正祛毒方上调CSLCs膜表面粘附分子αvβ3表达水平及4T1细胞、CSLCs的t-PA系统抑癌因子PAI-1、TFPI的表达水平有关。⑤扶正祛毒方能够显著抑制尾静脉接种肺转移模型小鼠肺转移的发生,其作用可能与扶正祛毒方抑制外周血液循环中IL-8水平,下调小鼠外周血PMNs整合素β2的表达水平,从而降低PMNs介导的肿瘤细胞、肿瘤干细胞的血管内皮粘附、外渗作用。⑥扶正祛毒方还可能通过上调肿瘤组织细胞表面粘附分子ICAM-1、αvβ3的表达水平,增强肿瘤细胞间的粘附作用,稳定瘤体,抑制肿瘤细胞的血行转移。