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猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染猪不仅天然免疫应答微弱,病毒特异性获得性免疫应答也出现迟且弱。PRRSV感染引起的免疫抑制是造成PRRSV持续性感染的主要原因。目前对于PRRSV引起的免疫抑制机理已经从病毒和宿主两方面都进行了广泛的研究,但从宿主效应细胞的角度进行的研究比较少。PD-1/PD-L通路主要调控机体获得性免疫应答水平,在许多人类疾病中证实与免疫逃避和持续性感染密切相关。本研究旨在克隆猪的PD-1基因,并研究PRRSV感染后对PD-1/PD-L通路的影响,为进一步探讨PD-1/PD-L通路与PRRSV的持续性感染之间的关系奠定基础。通过同源性搜索在GenBank数据库中找到了一条与人PD-1分子同源性较高的猪的EST序列。根据该序列设计引物,从猪PBMC中经RT-PCR扩增获得了该基因。测序表明,猪PD-1基因长867bp,编码288个氨基酸,与人和小鼠PD-1分子的氨基酸序列同源性分别为63%和54%,并且具有相似的分子结构包括信号肽和跨膜区两个疏水性区域和一个胞外区以及一个胞内区,且一些功能性的氨基酸和基序在三个种属间非常保守。为了验证猪PD-1能够与PD-L1结合,将猪PD-1的完整编码区克隆到pcDNA3.1载体中,转染293T细胞,用真核表达的可溶性蛋白PD-L1-Fc与转染细胞进行作用,通过流式细胞仪检测证实克隆的PD-1分子可以与已报道的猪的PD-L1结合。利用伪型逆转录病毒将克隆的PD-1基因转导猪PBMC,在体外用抗猪CD3分子的抗体刺激T细胞增殖时加入PD-L1-Fc融合蛋白,通过流式细胞仪检测进一步证实猪PD-1与PD-L1的相互作用可以抑制T细胞增殖和细胞因子分泌,说明猪PD-1分子与人和小鼠的PD-1分子一样是一个具有免疫负调控作用的协同刺激分子。针对猪PD-1、PD-L1和PD-L2基因序列分别设计了特异性引物和TaqMan探针,以系列稀释的重组质粒pMD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2为标准品,进行实时荧光定量PCR条件优化,建立了检测这三个基因的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法在1x102-1x108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数r2在0.99以上,扩增效率均高于96%,可检测至少100 copies的阳性标准品。对猪PBMC上这三个基因的表达情况进行检测表明该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可应用于临床样品的检测。将猪PD-1基因和PD-L1基因的胞外区分别克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pET32a上进行了表达。猪PD-1的胞外区以包涵体的形式表达,而PD-L1的胞外区为可溶性表达。将表达的蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了1株针对猪PD-1分子的单抗和2株针对PD-L1分子的单抗,并对这些单抗进行了Western blot分析和流式细胞仪检测,证实这些单抗不仅可以识别原核表达的变性蛋白,也可以识别真核细胞表面表达的膜型蛋白。利用上面建立的检测方法对PRRSV感染后效应细胞和靶细胞上PD-1及其配体的表达变化进行了监测。首先用PRRSV感染体外培养的原代PAM细胞,在感染后不同时间点收集细胞,利用荧光定量RT-PCR方法,以CyPA作为内参,比较感染细胞与正常培养细胞中PD-L1和PD-L2的表达变化。结果表明,PRRSV在感染后24h PD-L1的表达开始上调,与正常细胞相比上调了2.2倍,至感染后60h,上调倍数达到6倍左右。但PD-L2的表达几乎没有变化。通过对培养上清中的病毒毒价进行测定发现PD-L1的表达水平与病毒的复制水平之间呈正相关,说明PRRSV感染可以引起PD-1的配体PD-L1的表达量增加。然后用PRRSV感染40日龄仔猪,在感染后不同时间点采集PBMC,对PD-1的表达变化进行了监测。检测方法为相对荧光定量RT-PCR(以CyPA作为内参)和流式细胞术。利用荧光定量RT-PCR检测的结果表明,PRRSV感染猪PBMC中PD-1的表达在感染后3天就开始上调,与对照猪相比上调了约3倍,在感染后7-10天达到高峰,上调倍数约5倍左右。通过流式细胞仪检测PD-1的表达变化与荧光定量RT-PCR结果一致,在感染后7-14天,感染猪PBMC中CD4+T细胞和CD8+T细胞上PD-1的表达与对照猪相比都上调了2-3倍,至感染后35天,少数存活猪PD-1表达水平仍较高。利用荧光定量PCR检测方法对血浆中病毒载量进行了检测。通过将病毒载量与PD-1表达水平进行比较发现,二者之间呈正相关。上述结果说明PRRSV感染能够引起PD-1/PD-L通路的改变,至于这种变化的功能意义则需要进行更深入的研究。