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乳酸脱氢酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4)为乳酸脱氢酶(LDH)同工酶之一,特异地存在于哺乳动物及鸟类的睾丸和精子中。LDH-C4是精子能量代谢的关键酶之一,在精子活力、运动、获能及受精等过程中有着重要作用,其编码基因LDHC的缺失或突变可通过影响LDH-C4活性而导致男性不育。本课题组曾利用LDH-C4特异性底物α-羟基戊酸的染色方法在不明原因男性不育症患者中筛选精子LDH-C4活性低下者进行LDHC基因突变检测,检测到一杂合无义突变:L153X。为探讨L153X杂合无义突变引起男性不育的分子机制,本课题通过对人精子乳酸脱氢酶C4 L153X突变体的分子生物学鉴定、对患者精子的生化测定和获能试验,研究了L153X突变对患者精子功能的影响。通过免疫共沉淀、激光共聚焦荧光共定位及非变性聚丙烯凝胶电泳(PAGE)结合LDH-C4活性染色技术,研究了乳酸脱氢酶C4突变型亚基/多肽与野生型亚基的相互结合作用及其对人精子乳酸脱氢酶C4酶活性的影响。结果发现,带L153X无义突变的mRNA并没有被无义介导的降解的mRNA机制所降解,仍能被翻译成截短多肽,L153X截短多肽能够结合野生型C亚基,致使LDH-C4四聚体形成受阻,生成有酶活的四聚体大幅减少,导致患者精子中LDH-C4活性严重低下,进一步影响精子能量代谢和获能过程而最终导致男性不育。为制作L153X突变模式小鼠,本研究模拟人的L153X杂合无义突变,以小鼠为研究对象,通过生物信息学对小鼠LDH-C4及其L153X突变体的结构与功能等进行预测与分析。同时,采用分子克隆、基因定点诱变等技术,构建并获得了野生型小鼠LDH-C4及其L153X突变体的原核和真核重组载体。用重组质粒转染HEK293T细胞后,分析野生型C亚基与突变型C亚基之间的相互结合作用,模拟小鼠L153X纯合突变和杂合突变对LDH-C4酶活性的影响。结果显示:1)小鼠L153X突变体丧失了C末端近一半氨基酸残基、多个蛋白结合位点、底物结合位点和所有的酶活性位点,无法自发同源聚合形成具有催化活性的LDH-C4四聚体;2)小鼠L153X纯合突变和杂合突变均可导致LDH-C4酶活性的丧失或降低;3)野生型C亚基和突变型C亚基/多肽间存在相互结合作用,进一步影响LDH-C4四聚体聚合和蛋白质功能,最终影响LDH-C4酶活性。本研究为本课题小组前期“LDHC基因突变导致男性不育”假说提供了分子机制,并为相应突变模式小鼠的构建奠定了实验基础,所研究的显性负性机制尚未见于其他文献报道。