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研究目的肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一,也是威胁人类健康的重大疾病,其发病率一直很高。在我国,肝癌的死亡率位列第二、发病率位列第四。对于肝癌的诊断,主要是对肿瘤标志物的检测和影像学检查。对于肝癌的治疗的方法有很多,例如手术切除等。但是,尽管经过了有效的治疗,肝癌仍然有复发和转移的可能。因此,需要进一步阐明肝癌发生的分子机制,发现肝癌发生时有差异的分子和异常的信号通路,寻找有效治疗肝癌的新方法,为临床治疗提供新的方向。近年来的研究中有学者发现,在肝癌的发生发展过程中有异常活化的信号通路。值得我们重视的是,在肝癌发生发展过程中有Wnt经典信号通路的活化现象。Wnt信号通路是一条高度保守的信号通路,其在生物体的胚胎发育,组织修复与再生,调控生物体内与细胞生长、凋亡、自我更新和生存基因的表达发挥着重要的作用。根据所激活信号通路的不同,Wnt信号通路若依赖于β-catenin分子发挥作用则为经典的信号通路;若不依赖,则为非经典通路。关于Wnt与肝脏的研究主要集中于Wnt信号通路在肝纤维化过程中发挥的作用。研究表明,当经典的Wnt信号通路发生活化时可激活肝星状细胞而导致肝纤维化。但是,对于Wnt信号通路与肝癌的研究比较少,且目前对于Wnt家族分子的研究主要集中于Wnt3a与Wnt5a。在前期工作中我们发现,与正常肝组织相比,病变肝脏中Wnt2b分子呈现高表达趋势,并且与疾病严重程度有一定相关性。在TLR4促进HCC发生、TLR2抑制HCC发生的前提下,我们发现TLR4激动剂刺激人肝癌细胞系(HepG2,H7702)和鼠肝癌细胞系(Hepa1-6)Wnt2b表达上调,TLR2激动剂刺激则表达下调。这些结果提示我们,在肝癌的发生发展过程中,Wnt2b可能起到关键的作用。根据上述的实验现象,本研究在体外实验中利用分子生物学手段,探讨了 Wnt2b分子对肝癌细胞的肿瘤生物学特征的影响,并探讨相关机制;并通过体内实验证明,Wnt2b促进小鼠肿瘤的生长,且抑制肿瘤组织中NK细胞的数量和比例。另外,本研究初步探讨了抑制Wnt2b的表达辅助治疗肝癌的应用,为肝癌的治疗提供新的靶点和实验依据。研究方法1.以几种常见的人和鼠肝癌细胞系为模型,采用MTT法、细胞平板克隆实验检测TLR2激动剂Pam3CSK4和TLR4激动剂LPS对肝癌细胞增殖能力的影响。2.采用免疫荧光、免疫组化及western blot方法,检测TLR4对肝癌细胞系和肝癌组织中β-catenin的影响。3.以不同的TLR缺失小鼠为模型,采用半定量RT-PCR法检测Wnts mRNA的基础表达水平。采用半定量RT-PCR法,检测TLR2和TLR4对人肝癌细胞HepG2所有Wnts mRNA水平的影响。4.采用半定量RT-PCR法和western blot,检测TLR2和TLR4对人肝癌细胞HepG2、H7402和鼠肝癌细胞系Hepa1-6中Wnt2b mRNA的影响。5.采用MTT法检测Wnt2b对肝癌细胞增殖的影响。采用细胞集落形成方法和Real-time PCR探究Wnt2b对肝癌细胞系干性的影响。采用PI单染、Annexin V/PI双染法分别检测Wnt2b分子对肝癌细胞周期和凋亡的影响。6.采用western blot、定量PCR、MTT法检测Wnt2b对肝癌细胞的作用是否通过活化Wnt信号通路。7.动物实验采用皮下肿瘤组织荷瘤,细胞内转染质粒并瘤内注射的方法观察Wnt2b对肿瘤的影响,并用流式检测肿瘤组织和肝脏中淋巴细胞亚群的变化。研究结果1.TLR2抑制肝癌细胞系的增殖,TLR4则促进肝癌细胞系的增殖。TLR2抑制肝癌细胞的干性,TLR4则促进肝癌细胞的干性。2.TLR4促进肝癌细胞系中β-catenin的表达及入核。与TLR4缺失小鼠的肝癌组织相比,WT小鼠肝癌组织中β-catenin表达上调,且入核β-catenin增多。3.不同TLR缺失小鼠的肝组织中,Wnts的表达不同。TLR2激动剂刺激人肝癌细胞系HepG2,Wnt2分子,Wnt2b分子表达下调。在TLR4激动剂LPS刺激下,Wnt5a分子表达下调,Wnt2b分子表达上调。4.TLR2抑制肝癌细胞系中Wnt2b的表达,TLR4促进肝癌细胞系中Wnt2b的表达。5.Wnt2b促进肝癌细胞系的增殖。Wnt2b促进肝癌细胞的干性。Wnt2b抑制肝癌细胞系的凋亡,促进抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的表达,但不影响肝癌细胞系的周期。6.Wnt2b对肝癌的促进作用是通过活化Wnt/β-catenin信号通路实现的;沉默β-catenin后,Wnt2b则不能发挥促进肝癌的作用。7.Wnt2b促进肿瘤的生长并通过抑制肿瘤组织中NK细胞的数量。结论及意义1本文首次发现TLR2分子和TLR4分子在肝癌过程中对Wnt2b表达的影响,发现TLR4分子促进β-catenin的活化,为TLR信号通路与Wnt信号通路建立了联系。2首次发现Wnt2b对肝细胞癌细胞的促进作用,并阐明了其内在机制,发现通过活化Wnt信号通路,介导了肝癌细胞的增殖。在体内,Wnt2b促进肿瘤的生长通过抑制NK细胞,为今后肿瘤的治疗提供新的方向。