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一、前言胃癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国是死亡率最高的恶性肿瘤之一。目前胃癌的治疗一般采用手术、化疗、放疗、免疫治疗等综合措施,其中化疗具有手术和放疗不能替代的地位。但肿瘤细胞的耐药性,尤其是肿瘤的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)常导致化疗失败。据统计,晚期胃癌患者化疗有效率约为20%～40%,生存率平均6～12个月。肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞接触一种化疗药物并对其产生耐药后,同时对其它化学结构和作用机制不同的化疗药物亦产生耐药。转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGFβ)超家族是一类结构相似但功能不同的肽类物质,在肿瘤的发展过程中,其作用机制较为复杂。我们的早期研究发现TGFβ1除了明显促进胃癌细胞的浸润及转移外,还可显著增加SGC-7901细胞中谷胱甘肽S转移酶π(GST-π)的表达,且胃癌组织中TGFβ1与GST-π的表达水平呈正相关。有研究表明,GST-π表达水平的改变与化疗耐药有关,由此提示TGFβ1可能参与了胃癌细胞的耐药过程,但迄今为止尚未见TGFβ1与胃癌耐药相关的报道。二、目的本课题以TGFβ1处理SGC-7901细胞,观察其对化疗药物敏感性的变化,然后利用siRNA、蛋白质组学,Western blotting等技术分析可能参与此过程的信号分子,以探讨TGFβ1促胃癌耐药的分子机制,为临床克服耐药现象提供新的干预靶点。三、方法与结果1、利用MTT法检测经TGFβ1预处理过的SGC-7901和未经TGFβ1预处理过的SGC-7901对丝裂霉素的敏感性,结果发现:丝裂霉素对SGC-7901细胞的抑制率为89.5±10.6%;经10ng/ml TGFβ1预处理后,丝裂霉素对SGC-7901细胞的抑制率降为35.0±4.1%,二者间有显著性差异(反应细胞增殖情况OD490值的比较,均P＜0.05)。表明TGFβ1预处理可降低SGC-7901细胞对丝裂霉素的敏感性,诱导其对丝裂霉素耐药。表明TGFβ1能增强肿瘤细胞的耐药性。2、运用Hoechst 33258荧光染色法及流式细胞术检测了TGFβ1处理前后SGC-7901细胞凋亡率的变化,结果发现TGFβ1处理对SGC-7901细胞的凋亡率无影响。3、采用高通量的蛋白质组学技术,通过二维凝胶电泳技术分析经TGFβ1预处理的SGC-7901细胞和未处理的SGC-7901细胞的差异蛋白表达谱,结合基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术初步鉴定差异蛋白,以初步探讨TGFβ1诱导SGC-7901细胞耐药的作用机制。比较两组细胞总蛋白的2-D图谱后,在相同的实验条件下,它们蛋白质点的分布十分相似,位置重复性分析表明TGFβ1处理SGC-7901细胞在等电聚焦(IEF)方向上的平均偏差为0.908±0.102mm,在垂直板SDS-PAGE电泳方向上的平均位置偏差为1.032±0.108mm;未处理SGC-7901细胞在IEF方向上的平均偏差为0.838±0.116 mm,在垂直板SDS-PAGE电泳方向上的平均位置偏差为1.075±0.168 mm。表明我们成功地建立了分辨率较高,重复性较好的TGFβ1预处理SGC-790l细胞和未处理SGC-7901细胞的二维凝胶电泳图谱。使用PDquest分析软件对TGFβ1预处理SGC-7901细胞和未处理SGC-7901细胞的各蛋白质点的表达丰度进行分析,我们发现30个差异点,随机选取2个差异点,经原位酶解和MALDI-TOF质谱分析测定它们的PMF,初步鉴定了其中的2个蛋白质点。部分候选的蛋白质差异表达水平经Western blotting分析可以看出SGC-7901细胞经TGFβ1处理后GST-π,MDR1蛋白表达上调,这些结果与我们蛋白质组学的分析结果是一致的。4、应用免疫组织化学方法检测TGFβ1、GST-π和MDR1在胃癌组织中的表达情况并分析其与临床病理参数间的关系。结果表明:TGFβ1、GST-π和MDR1的阳性信号主要在细胞浆。在76例胃癌组织中,TGFβ1、GST-π和MDR1的阳性率分别为75%、81.5%及61.8%,且三种蛋白的表达均与分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关(P＜0.05),但与年龄和性别等无关(P＞0.05)。5、利用Smad4 siRNA、MAPK通路特异性阻断剂处NSGC-7901细胞,然后分别检测GST-π、MDR1的表达水平,以期明确TGFβ1上调GST-π、MDR1表达的信号途径。结果表明:TGFβ1作用SGC-7901细胞后GST-π的表达水平明显上调,但经Smad4 siRNA及PD98059预处理后,其表达水平随之降低;而在SB203580及SP600125处理组GST-π的表达水平无明显变化,提示TGFβ1可能通过经典Smad通路及ERK途径诱导SGC-7901细胞GST-π的表达。而利用外源性TGFβ1处理胃癌细胞SGC-7901,探讨其对SGC-7901细胞MAPK通路的影响时亦发现,SGC-7901的p-ERK表达水平上调,这亦再次表明ERK通路在此分子事件中发挥了重要作用。同时本实验中,我们亦发现TGFβ1作用SGC-7901细胞后MDR1的表达明显上调,但在经SP600125及PD98059预处理后,其表达水平随之降低;而在SB203580及Smad4 siRNA处理组MDR1的表达水平无明显变化,这就提示TGFβ1可能通过JNK通路及ERK途径诱导SGC-7901细胞MDR1的表达。而利用外源性TGFβ1处理胃癌细胞SGC-7901,探讨其对SGC-7901细胞MAPK通路的影响时亦发现,SGC-7901的p-ERK、p-JNK表达水平上调,这亦再次表明ERK、JNK通路在此分子事件中发挥了重要作用。四、结论1、成功发现TGFβ1可诱导胃癌细胞耐药的发生,其部分机制可能与上调GST-π和MDR1的表达相关;2、首次发现TGFβ1可分别通过经典Smad通路、ERK途径及JNK、ERK通路上调SGC-7901细胞GST-π和MDR1的表达。