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以灰黄霉素产生菌——(Penicillium patulum)FS80-1为出发菌株,采用UV-LiCl进行复合诱变,经过三轮选育获得高产突变株GM120-43,经重氮盐显色法检测,其产灰黄霉素能力达到89496μg/g,与出发菌株FS80—1相比提高了80.04％,遗传稳定性良好。以UV-LiCl复合诱变获得的突变株GM120-43为出发菌株,采用半导体激光和CO2激光进行诱变,分别获得突变株LD100-1和C1448-1。突变株LD100-1经遗传稳定试验后,产灰黄霉素的效价达到119766μg/g,比出发菌株GM120-43提高了22.58％。由CO2激光诱变获得的突变株C1448-1经遗传稳定性试验后,产灰黄霉素的效价低于出发菌株GM120-43。对突变株LD100-1进行固体培养条件研究,结果表明最佳培养条件如下:碳源基质为晚籼米；氮源为NaNO3；培养基固形物的料水比以1:0.75为宜；灰黄霉素合成的前体氯化物以单加NaCl为宜,且Cl-浓度为0.188 mol/L是较适宜的；采用液体液体种子液接种,菌龄以44 h,接种量为10％为宜。通过培养条件优化之后,LD100-1产灰黄霉素效价达162233μg/g,比未优化之前提高了39.16％。
将出发菌株FS80-1及突变株GM120-43、LD100-1的大米孢子培养物用无水乙醇进行提取。采用HPLC对提取液中灰黄霉素含量进行检测,比较HPLC和重氮盐显色法两种检测方法的差异性,检测结果表明:菌株FS80-1、GM120-43和LD100-1产灰黄霉素能力分别为43511μg/g、91858μg/g和105423μg/g,HPLC的检测结果比重氮盐显色法检测结果稍微偏低。
提取突变株GM120-43、LD100-1和出发菌株FS80-1的基因组DNA,并以其基因组DNA为模板,利用18S通用引物进行PCR扩增,将扩增到的18S rDNA测序并比对,发现突变株GM120-43和LD100-1两者之间的序列差异性很小,只是个别碱基不同,而与FS80-1相比有多处碱基存在差异,其中有三个区域序列差异性较大。
对出发菌株FS80-1及突变株GM120-43、LD100-1液体发酵中装液量以及α-淀粉酶酶活进行研究,结果发现灰黄霉素产生菌——展青霉对氧气的需求量很大,250mL三角瓶装30 mL的发酵液为宜。同时检测发现,突变株GM120-43在发酵3 d时,产α-淀粉酶酶活力最高,酶活力可达到82.3 u/mL。发酵结束后,镜检发现,相对出发菌株FS80-1和突变株LD100-1而言,突变株GM120-43产分生孢子量教少,发酵产灰黄霉素效价比出发菌株FS80-1及突变株LD100-1高。