论文部分内容阅读
油酸是一种可再生的生物质资源,通过油酸水合酶(PaOH)的催化可以转化为10-羟基硬脂酸;后者在醇脱氢酶(ADH)作用下可转化为10-羰基硬脂酸,再通过进一步酶法转化,可以生产中等链长(C8-C10)的脂肪醇、脂肪酸、羟基脂肪酸、氨基脂肪酸及二元酸。因此,10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸成为油酸生物炼制过程的关键中间体,同时也是高价值的精细化学品。ADH催化的氧化反应需要辅酶NAD+的参与,在反应过程中需要对NAD+进行循环再生以降低反应成本。本论文对油酸水合酶PaOH进行分子改造,提高了其催化活性及热稳定性;选择NADH氧化酶催化NAD+再生,并通过耦联过氧化氢酶,原位分解双氧水提供氧气作为NAD+再生的辅底物,降低了 10-羰基硬脂酸的生产成本。(1)建立油酸水合酶高通量筛选方法。利用M luteus WIUJH20来源的MlADH,催化10-羟基硬脂酸脱氢反应将NAD+还原为NADH,加入过量的吩嗪乙基硫酸盐(PES)和噻唑蓝(MTT)与NADH反应,可定量地生成一种蓝紫色产物,该物质在580 nm处具有可见光吸收峰,可使用分光光度计进行定量检测。此方法对10-羟基硬脂酸的检测限为0.01 mM,且当10-羟基硬脂酸浓度在0.01-1.00 mM区间线性良好,适合用于油酸水合酶的活性筛选。(2)改造油酸水合酶的活性及热稳定性。以实验室前期筛选的来源于Paracoccus aminophilus的油酸水合酶(简称PaOH)为亲本,通过半理性设计和易错PCR法对酶进行分子结构改造,得到活性提高1.4-3.4倍的3个优良突变体;其中最优突变体PaOH-M4的催化效率常数(kcat/KM)是亲本的3.5倍。(3)优化多酶级联催化合成10-羰基硬脂酸的反应过程。采用一釜两步酶法级联的反应方式合成了 10-羰基硬脂酸,并对级联反应中催化剂上载量以及过氧化氢流加液的浓度等因素进行了优化。使用油酸水合酶PaaOH-M4催化合成10-羟基硬脂酸,当底物浓度为50 g·L-1,酶上载量为2,500 U·L-1时,反应2h后底物转化率即达到98.5%以上;调节反应液pH后,直接加入MlADH、NADH氧化酶以及过氧化氢酶,级联催化合成10-羰基硬脂酸,反应4 h后转化率达98.2%,产品的分离得率为79.5%,纯度达99.0%。