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右旋糖酐作为典型的多糖类药物之一,其分子量大小及其分布与其性质及药理活性息息相关,传统制备右旋糖酐的方法“菌体发酵-酸降解-乙醇沉降”对分子量控制效果不理想,很大程度上限制了右旋糖酐在医药领域的推广应用;也有利用超声波的空化效应降解大分子右旋糖酐的研究,但超声降解存在一个“极限”,即超声一般只对极限分子量以上的右旋糖酐有较明显的降解作用;利用双酶(Dextransucrase合成酶和Dextranase分解酶)法定向合成药用右旋糖酐可以很好地对其分子量进行控制,大量获得临床药用所需分子量分布范围的系列右旋糖酐制剂,且产物更均一,产率更高,有很好的产业化应用前景。目前,极少有商品级的Dextransucrase合成酶,且合成酶对合成产物右旋糖酐分子量的控制也没有体现专一性。双酶法定向合成对产物分子量及均一性有很好地控制,但这一合成过程的规律还不明确,过程调控与机理还有待深入了解。本课题以Dextransucrase合成酶(DS)为聚合催化剂、Dextranase分解酶(DN)为聚合调控剂、蔗糖为聚合底物构建生物体外右旋糖酐的合成路线,量化研究右旋糖酐聚合过程,探索聚合重复单元、聚合模式及其稳定性,以及双酶体系合成右旋糖酐过程和Dextranase分解酶降解调控过程的规律和特征,揭示高合成通量高转化率定向合成过程的影响因素及控制途径,开展右旋糖酐聚合过程动力学研究。并对比研究了不同初始分子量右旋糖酐的酶降解与超声物理场降解过程,分析评价了两种调控途径的规律及特点,为定向制备右旋糖酐提供理论参考。主要研究内容和结论如下:(1)单酶(DS)体系合成右旋糖酐的聚合过程规律研究。以蔗糖为聚合底物、Dextransucrase合成酶为聚合催化剂构建右旋糖酐酶法合成体系,实验结果表明,在本实验的单酶(DS)合成体系中,不同底物蔗糖浓度和不同初始酶量条件下,各个反应时间段的产物右旋糖酐的分子量均主要集中在>106Da与103-104Da这两个范围内,且随着反应的进行,几乎未检测到这两个分子量范围外的右旋糖酐产物,说明右旋糖酐分子量增大模式可能是以简单的葡萄糖基连接成低分子量右旋糖酐片段的慢速模式与以低聚葡萄糖链接枝成高分子量右旋糖酐片段的快速模式同时存在。(2)双酶(DS/DN)体系合成右旋糖酐的聚合过程规律研究。以蔗糖为聚合底物、Dextransucrase合成酶为聚合催化剂、Dextranase分解酶为聚合调控剂构建双酶(DS/DN)合成体系,实验结果表明,在本实验的双酶(DS/DN)合成体系中,同一实验条件下,产物右旋糖酐的分子量主要集中同一分子量范围内。但当蔗糖浓度一定,双酶添加量不同时,各反应的产物右旋糖酐的分子量主要集中的分子量范围不同;当双酶添加量一定,蔗糖浓度不同时,产物右旋糖酐的分子量主要集中的分子量范围却接近,表明双酶合成体系定向合成右旋糖酐时,Dextranase分解酶可以很好地调控产物右旋糖酐的分子量。随着反应的进行,合成产物右旋糖酐的均一性也都有所提升。在同一底物浓度、Dextransucrase合成酶添加量条件下,加入Dextranase分解酶的双酶合成体系比单酶合成体系优先检测到右旋糖酐分子片段,且主要集中的分子量范围不同,说明在双酶合成体系下,Dextranase分解酶不仅可以很好地调控产物右旋糖酐分子量,还可能促进了Dextransucrase合成酶对右旋糖酐的聚合。根据酶催化动力学特征分析,发现双酶(DS/DN)体系合成右旋糖酐的合成动力学符合Malhotra模型。(3)Dextranase分解酶降解调控过程规律研究。以不同初始分子量的右旋糖酐为底物、Dextranase分解酶为催化剂构建酶降解调控体系,实验结果表明,通过酶降解不仅可以得到低分子量右旋糖野,还可以提高产物右旋糖酐的均一性;在酶降解的初始阶段,降解作用更加显著,尤其对于较高初始分子量和较低浓度的右旋糖酐样品来讲。在酶降解过程中,高分子量的右旋糖酐片段优先被降解。此外,现有实验条件下,随着降解时间的延长,Dex-270,Dex-1000,Dex-2000 和 Dex-F 四个样品中的 104-105 Da分子量片段的占比呈增加趋势。不同初始分子量、不同底物浓度和不同酶浓度条件下,右旋糖酐分子量降解动力学均符合二级反应动力学方程。(4)酶(DN)降解与超声降解的降解过程规律对比研究。实验结果表明,对于两者降解过程规律而言,样品初始分子量越大,降解作用越明显,而且在降解开始阶段(0-10 min),分子量减小最快;右旋糖酐分子量降解动力学均符合二级反应动力学方程。但对于低分子量右旋糖酐而言,酶降解作用比超声降解作用更明显。同时,在分子量降低时,超声物理场降解条件下,右旋糖酐的D值也随着减小;在酶降解条件下,右旋糖酐的D值呈现先增大后减小的趋势,且分子量越大D值越容易达到最大值;反应后期两者均可以提高右旋糖酐降解产物的分子量均一性。样品Dex-F在降解反应的最后,酶降解条件下,高分子量(>106Da)的右旋糖酐被降解完全,而超声降解条件下,高分子量(>106Da)的右旋糖酐却依然存在。相比较而言,酶降解更易得到不同低分子量的右旋糖酐,且分子量范围更集中。